靶向uPAR的双特异性T细胞衔接器GFD-CD3在小鼠与非人灵长类中的衰老细胞清除作用及以血清氨基转移酶活性作为安全性监测指标

《Aging Cell》：uPAR-Targeting T Cell Engager Exerts Senolytic Effects in Mice and Non-Human Primates With Serum Aminotransferase Activity as a Safety Monitor

　　

靶向uPAR的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）可诱导剂量依赖性毒性。尽管在实验小鼠中可通过调整剂量缓解这些毒性，但由于CAR-T细胞在不同患者群体中增殖的不可预测性，临床转化仍具挑战性。相比之下，双特异性T细胞衔接器（BiTEs）提供了更安全的选择，并具有优越的剂量可滴定特性。在此，研究人员利用天然配体uPA的生长因子样结构域（GFD）作为靶向部分，开发了一种GFD-CD3 BiTE，用于靶向uPAR阳性的衰老细胞。剂量范围探索研究发现，高剂量GFD-CD3主要通过T细胞介导的对肝内皮细胞的攻击诱导肝毒性。至关重要的是，在转氨酶指导的监测下，低剂量GFD-CD3有效清除了衰老细胞，并减轻了老年小鼠和非人灵长类的年龄相关病理，且未产生不良效应。这些发现确立了GFD-CD3作为一种可临床转化的抗衰老药物，并为BiTE作为抗衰老策略提供了令人信服的临床前证据。

研究背景与科学问题

细胞衰老是衰老的核心标志和驱动因素。研究表明，即使移植少量衰老细胞也能促进小鼠的衰老进程，而清除衰老细胞则可延长健康寿命并改善衰老相关表型。因此，开发安全有效的抗衰老药物成为极具前景的策略。目前已发现多种小分子抗衰老候选药物，如达沙替尼（dasatinib）联合槲皮素（quercetin）、非瑟酮（fisetin）和UBX0101等，但其临床疗效普遍低于预期，且常伴有腹泻、贫血、皮疹等毒副作用，主要原因是大多数小分子抗衰老药物的靶向特异性不足。

为提高安全性和有效性，研究人员转向开发靶向衰老细胞膜标志物的高度特异性免疫疗法。例如，靶向CD153或糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（GPNMB）的抗衰老疫苗，以及靶向尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）和NKG2D配体的CAR-T细胞，均被证明能有效清除衰老细胞。其中，uPAR作为衰老细胞和肿瘤细胞广泛表达的标志物，成为重要靶点。然而，高剂量的uPAR CAR-T细胞会引发低体温、体重下降等副作用，凸显了对更安全的uPAR靶向抗衰老药物的需求。双特异性T细胞衔接器（BiTEs）因其可招募内源性T细胞、具有更好的剂量可滴定性和更低毒性而成为潜在替代方案。此外，利用天然配体/受体相互作用作为免疫治疗的识别域，因其适中的亲和力可能带来合理的安全性。基于此，研究人员开发了基于uPA天然配体生长因子样结构域（GFD）的BiTE——GFD-CD3，旨在实现安全有效的衰老细胞清除。

研究方法概述

研究人员首先通过基因重组技术构建了人源和鼠源的GFD-CD3 BiTE分子，并在HEK-293F细胞中表达纯化。体外实验中，利用过氧化氢酶或P16^INK4a过表达诱导人胚肺成纤维细胞HEL1和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进入衰老状态，通过流式细胞术、免疫荧光和共培养杀伤实验验证BiTE的结合特异性和T细胞介导的细胞毒性。体内研究中，对自然衰老的小鼠（22月龄）进行剂量梯度给药，通过血清生化分析、组织病理学检查和免疫荧光染色评估安全性和疗效。进一步在uPAR基因敲除小鼠和巨噬细胞缺陷的NSG小鼠中进行机制验证。在非人灵长类（恒河猴）中，通过单次剂量递增试验确定安全剂量后，对24岁老龄猴进行多次给药，收集血液、皮肤、脂肪和肌肉组织样本，通过qPCR、SA-β-Gal染色和ELISA评估衰老标志物和炎症因子的变化。

研究结果

2.1 GFD-CD3在体外介导T细胞裂解人衰老细胞

研究人员将人uPA的GFD结构域与人抗CD3单链可变区片段（scFv）连接，构建了hGFD-CD3 BiTE。流式细胞术证实其能有效结合uPAR阳性的衰老细胞和CD3阳性的T细胞。在共培养体系中，hGFD-CD3以剂量依赖方式杀伤衰老细胞，半数抑制浓度（IC50）低至0.015 nM，同时伴随肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子水平升高，以及T细胞活化标志物CD69和CD25的上调和颗粒酶的释放。对照分子对年轻细胞或衰老细胞无明显细胞毒性。

2.2 高剂量GFD-CD3通过靶向肝内皮细胞诱导肝毒性

在22月龄小鼠中，1 mg/kg的mGFD-CD3导致小鼠24小时内死亡，0.3 mg/kg引起竖毛、精神萎靡、厌食等症状，伴血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高20-30倍，白细胞介素-6（IL-6）升高4倍。组织病理学分析显示肝脏损伤，其他器官未见明显异常。免疫荧光染色证实uPAR在肝内皮细胞（CD31阳性）中表达，mGFD-CD3在肝脏中与uPAR和CD31共定位，并导致CD31阳性细胞显著减少。在uPAR基因敲除小鼠中，mGFD-CD3不再诱导肝损伤或转氨酶升高。此外，在巨噬细胞缺陷的NSG小鼠中，GFD-CAR-T细胞同样引起肝毒性，表明肝毒性不依赖于巨噬细胞。这些结果共同证明，uPAR靶向治疗引起的肝毒性源于对肝内皮细胞的攻击。

2.3 mGFD-CD3在自然衰老小鼠中有效介导T细胞清除衰老细胞

采用0.1 mg/kg的低剂量每周一次给药，连续三周后检测。mGFD-CD3显著降低了多种组织中uPAR、P16^INK4a和P21的表达，减少了脂肪、肝脏和肺组织中的SA-β-Gal染色强度。肝脏RNA测序（RNA-seq）分析显示，衰老相关分泌表型（SASP）基因和SenMayo基因集表达显著降低，炎症相关通路基因表达下调。免疫荧光观察到BiTE、CD3和SA-β-Gal在肝肺组织中共定位，表明BiTE成功将T细胞招募至衰老细胞。外周血中CD25阳性T细胞增加，证实T细胞被激活。中性粒细胞数量在给药后6小时短暂下降，24小时内恢复。

2.4 mGFD-CD3清除衰老细胞改善小鼠年龄相关表型

对20月龄小鼠进行为期3个月的长期治疗后，循环中TNF-α和IL-1β等SASP因子水平显著降低。组织学分析显示：腹股沟脂肪细胞面积增大；肝脏和肺脏纤维化区域减少；肾小球硬化减轻；股骨中破骨细胞数量减少、成骨细胞活性增强。6个月后，治疗组小鼠的运动能力（最大行走速度、跑步耐力、悬挂耐力和抓力）显著提高，骨骼肌纤维密度增加，股骨远端骨量丢失减少。双能X射线吸收测定法（DXA）和显微CT（micro-CT）分析显示，治疗组瘦组织比例增加，脂肪组织与瘦组织比值降低，腹部皮下脂肪体积增大。葡萄糖耐量试验（IPGTT）和胰岛素敏感性试验（ITT）表明，治疗组小鼠的血糖稳态和胰岛素敏感性得到改善。

2.5 hGFD-CD3在老龄非人灵长类中的安全性

在24岁恒河猴（相当于人类约70岁）中进行单次剂量递增试验。10和20 μg/kg剂量未见明显异常，仅20 μg/kg时AST轻度升高。40 μg/kg剂量引起精神状态轻微受损、厌食，AST和ALT升高50%-100%，但仍处于正常参考范围内。选择20 μg/kg进行后续实验，两只24岁猴接受每三天一次的给药方案。其中一只猴（00016）首次注射后出现厌食，AST和ALT一过性升高（AST峰值108 U/L，ALT峰值134 U/L），IL-6升高约4倍，但这些异常均在3天内消退。血液学参数和生命体征在首次给药后出现短暂波动，随后趋于稳定。

2.6 hGFD-CD3清除非人灵长类中的衰老细胞

在给药后第42天和第90天收集皮下脂肪组织（SAT）、骨骼肌（SKM）和皮肤样本。SA-β-Gal染色显示，第42天SAT中衰老细胞数量减少，第90天有所回升。qPCR检测显示，uPAR、P16^INK4a和P21的mRNA表达在第42天降低，第90天恢复。组织中免疫细胞标志物（巨噬细胞、T细胞、NK细胞）表达水平下降。血清SASP因子浓度在第42天显著降低，第90天恢复至基线水平。这些结果表明，hGFD-CD3成功清除了衰老细胞并降低了慢性炎症，但衰老细胞约在3个月后重新积累。

讨论与结论

本研究发现肝毒性是uPAR靶向治疗的主要剂量限制性毒性，其根源在于肝内皮细胞表达uPAR。这种毒性可通过血清ALT和AST等肝功能指标进行有效监测。在优化剂量下，GFD-CD3能有效清除老年小鼠和非人灵长类的衰老细胞，带来多方面的益处，包括减轻组织纤维化、减少骨丢失、改善代谢功能和增强运动能力。与CAR-T细胞相比，BiTE疗法具有更好的剂量可滴定性和“打就跑”的药代动力学特征，半衰期短，可快速停药或调整给药频率以降低副作用。此外，GFD-CD3仅需每周一次、连续三周的给药方案即可实现抗衰老效果，而此前报道的嵌合肽E16-uPA₂₄需要每周三次、持续两个月的高频给药。研究还指出，uPAR在肝内皮细胞中的表达随年龄增长而增加，这突显了在老年人群中进行严格肝脏监测的必要性。尽管GFD-CD3在预防性应用时需要谨慎权衡风险收益比，但对于已经构成明确健康威胁的衰老相关疾病，如慢性肾病、阿尔茨海默病和肝纤维化，其临床需求更为迫切，优先将这些疾病作为临床探索的适应症可能更为合理。

结论：本研究建立了GFD-CD3作为一种可临床转化的抗衰老药物，并提供了BiTE作为抗衰老策略的令人信服的临床前证据。通过转氨酶指导下的剂量监测，低剂量GFD-CD3能够在不引起不良效应的情况下有效清除衰老细胞并逆转年龄相关病理，其可预测和可监测的肝毒性可通过剂量滴定和生物标志物引导的监测进行管理，从而确保临床应用的安全性。