α-突触核蛋白通过损害巨噬细胞自噬流促进动脉粥样硬化

《Aging Cell》：α-Synuclein Promotes Atherosclerosis by Impairing Macrophage Autophagic Flux

摘要专业翻译 动脉粥样硬化（atherosclerosis）被公认为一种典型的衰老相关血管疾病，其发生由巨噬细胞泡沫细胞（foam cell）形成所驱动。帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者卒中风险升高。尽管α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）在PD中的神经元作用已为人所知，但其在循环中的存在及潜在的血管效应仍未被探索。本研究将α-Syn鉴定为一种此前未被认识的循环促动脉粥样硬化因子。研究者在人动脉粥样硬化斑块中检测到α-Syn。在前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）过表达诱导的动脉粥样硬化小鼠模型中，α-Syn基因（Snca）敲除减少了动脉粥样硬化病变面积和巨噬细胞脂质蓄积。相反，在载脂蛋白E敲除（Apoe?/?）小鼠中给予外源性α-Syn则加速了动脉粥样硬化。机制上，α-Syn通过损害自噬流（autophagic flux）促进巨噬细胞泡沫细胞形成，并伴随磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的激活。蛋白质组学分析鉴定出膜筏蛋白flotillin-1（FLOT1）为候选上游介导因子。Flot1敲低减少了α-Syn的内化、PI3K磷酸化、自噬损害及脂质蓄积，而PI3K或mTOR的药理学抑制则减弱了α-Syn的上述效应。综上，这些发现揭示了一条FLOT1相关通路，通过该通路，细胞外α-Syn破坏巨噬细胞自噬并促进动脉粥样硬化。

论文解读

一、研究背景与科学问题

动脉粥样硬化（atherosclerosis）是一种典型的衰老相关血管疾病，也是大多数心血管事件的病理基础。其关键早期事件是巨噬细胞来源的泡沫细胞（foam cell）形成，源于脂质摄取、细胞内降解和胆固醇外流之间的失衡。在经典的脂质处理通路之外，自噬-溶酶体系统（autophagy-lysosome system）已被证实是巨噬细胞内脂质稳态的关键调节者。通过脂噬（lipophagy），脂滴被运送至溶酶体进行水解，从而产生可供细胞外流的游离胆固醇。自噬流（autophagic flux）受损会促进脂滴蓄积和泡沫细胞形成，而衰老相关的自噬功能下降日益被认为是血管病理的重要促成因素。然而，在动脉粥样硬化中破坏巨噬细胞自噬的上游因素仍未完全阐明。

α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）是一种小分子胞质蛋白，以在帕金森病（Parkinson's disease, PD）及相关突触核蛋白病中的作用而闻名。尽管α-Syn在神经元中高度富集，其在细胞外液和外周组织中也存在，且PD患者循环α-Syn水平升高。流行病学研究提示PD与动脉粥样硬化性血管疾病负担增加相关，包括颈动脉斑块患病率升高和缺血性卒中风险增加，提示α-Syn相关病理与血管衰老之间存在潜在联系。此外，α-Syn已被检测到存在于高密度脂蛋白（HDL）和脂蛋白(a)组分中，其两亲性α-螺旋结构域和胆固醇结合能力使其能够与脂质膜结合，且既往研究提示α-Syn参与囊泡运输、细胞内胆固醇代谢和脂滴（lipid droplet, LD）蓄积。然而，α-Syn是否直接调控巨噬细胞脂质代谢从而促进动脉粥样硬化发生，此前尚不清楚。尽管α-Syn干扰自噬在神经元系统中已有广泛研究，但其是否改变巨噬细胞中的自噬流仍属未知。本研究旨在评估α-Syn对小鼠模型动脉粥样硬化病变发展及体外巨噬细胞脂质蓄积的影响，并探讨其分子机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过结合人斑块标本、体内动物模型和体外功能实验，系统阐明了α-Syn促进动脉粥样硬化的作用及机制。主要结论为：α-Syn是一种此前未被认识的循环促动脉粥样硬化因子，通过FLOT1介导的内化激活PI3K-AKT-mTOR-S6K信号通路，损害自噬体-溶酶体融合，抑制脂噬和胆固醇外流，从而促进巨噬细胞泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展。

三、关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术手段：①收集3例接受颈内动脉内膜剥脱术患者的动脉粥样硬化斑块标本（经华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会批准），通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和免疫印迹（WB）检测斑块中α-Syn的存在；②利用Snca基因敲除小鼠（购自Jackson Laboratory）和Apoe^?/?小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）建立AAV-PCSK9注射联合高胆固醇饮食（HCD）诱导的动脉粥样硬化模型；③体外培养RAW264.7巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM），进行油红O（ORO）染色、BODIPY染色、DiI-ox-LDL摄取实验、NBD-胆固醇外流实验；④采用LysoTracker染色、免疫荧光（IF）共定位分析、透射电子显微镜（TEM）以及RFP-EGFP-LC3串联荧光报告系统评估自噬流；⑤通过蛋白质组学分析、Flot1 siRNA敲低、免疫共沉淀（Co-IP）和药理学抑制剂（LY294002、雷帕霉素）实验阐明信号通路机制。

四、研究结果

2.1 SNCA敲除小鼠表现出减轻的动脉粥样硬化

研究人员首先在人颈动脉粥样硬化斑块中通过LC-MS/MS检测到α-Syn特异性肽段，并通过WB验证了α-Syn免疫反应性条带的存在。随后利用AAV-PCSK9联合HCD诱导的动脉粥样硬化模型发现，与野生型对照相比，雄性Snca^?/?小鼠全主动脉和主动脉弓的病变面积显著减小，主动脉根部斑块面积、坏死核心比例和脂质沉积均降低。雌性小鼠呈现一致的表型。免疫荧光分析显示，Snca^?/?小鼠斑块中CD68⁺BODIPY⁺巨噬细胞源性泡沫细胞密度降低，而ACTA2⁺BODIPY⁺血管平滑肌细胞（VSMC）相关脂质蓄积无显著差异。这表明Snca缺失减轻动脉粥样硬化主要归因于巨噬细胞相关脂质蓄积的减少。

2.2 α-突触核蛋白通过诱导巨噬细胞泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化

体外实验中，Snca^?/?与Snca^+/+来源的BMDM在ox-LDL处理后的ORO阳性面积相当，提示内源性Snca缺失不改变巨噬细胞固有的泡沫化能力。然而，外源性α-Syn与ox-LDL共处理显著增强了RAW264.7巨噬细胞的脂质蓄积。α-Syn不影响DiI-ox-LDL的摄取，但显著抑制了HDL和APOA1介导的胆固醇外流，而经典脂质处理受体和转运蛋白（CD36、MSR1、OLR1、ABCG1、ABCA1）的表达未受影响。在Apoe^?/?小鼠中，尾静脉注射外源性α-Syn显著增加了全主动脉和主动脉弓的脂质沉积、斑块面积和坏死核心比例，并增加了CD68⁺BODIPY⁺细胞密度，而对VSMC相关脂质蓄积无影响。

2.3 α-突触核蛋白破坏巨噬细胞中的自噬体-溶酶体融合

α-Syn处理导致LC3B-II和SQSTM1蓄积，氯喹（CQ）预处理后LC3B-II不再进一步增加，提示降解阶段受阻。α-Syn未改变Lc3b mRNA水平，但增加了Sqstm1 mRNA水平。免疫荧光显示α-Syn处理后BODIPY与LysoTracker、BODIPY与LC3的共定位均减少，LC3与LAMP1的共定位也显著降低。透射电镜观察到α-Syn处理的巨噬细胞自噬溶酶体数量减少、脂滴增大。RFP-EGFP-LC3报告系统显示α-Syn处理后红色斑点（自噬溶酶体）显著减少，黄色斑点（自噬体）比例增加，证实自噬过程停滞在自噬体与溶酶体融合阶段。

2.4 PI3K-AKT-mTOR-S6K信号激活是α-Syn诱导自噬损害的基础

α-Syn未改变SNARE融合复合物蛋白（SNAP29、STX17、VAMP8）的表达。α-Syn显著增加了mTOR、S6K和ULK1（Ser757）的磷酸化，而AMPK磷酸化不变。α-Syn还增加了PI3K和AKT的磷酸化。PI3K抑制剂LY294002预处理可降低α-Syn诱导的mTOR磷酸化增加。雷帕霉素（mTOR抑制剂）或LY294002预处理消除了α-Syn诱导的LC3B-II升高，部分减轻SQSTM1蓄积，并减弱了α-Syn诱导的脂质蓄积。

2.5 FLOT1介导α-Syn内化并促成α-Syn诱导的自噬损害和脂质蓄积

蛋白质组学分析鉴定出FLOT1在α-Syn处理的细胞中显著上调，WB进一步验证。Flot1敲低显著减少了α-Syn的内化，免疫荧光显示细胞内α-Syn与FLOT1存在空间共定位，Co-IP证实FLOT1与α-Syn存在蛋白水平关联。Flot1敲低消除了α-Syn诱导的PI3K磷酸化增加，阻止了LC3B-II蓄积，减少了SQSTM1上调，并恢复了HDL介导的胆固醇外流，减弱了α-Syn诱导的泡沫细胞形成。在α-Syn注射的Apoe^?/?小鼠主动脉根部斑块中，FLOT1⁺CD68⁺细胞密度高于PBS处理组。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，α-Syn不仅存在于脑内，也存在于外周组织，可通过局部表达或中枢来源的转运到达外周。研究人员在人动脉粥样硬化斑块中检测到α-Syn特异性肽段和多种免疫反应性条带，补充了α-Syn在血管病变中存在的证据。在Snca敲除小鼠中观察到一致的动脉粥样硬化保护表型，以外周循环系统为研究焦点，为现有知识体系提供了重要补充。外源性α-Syn暴露增强巨噬细胞泡沫细胞形成并加速动脉粥样硬化进展，提示Snca^?/?小鼠的动脉粥样硬化保护表型可能源于对血管内源性外源α-Syn暴露的减少。机制上，α-Syn通过损害自噬体-溶酶体融合抑制自噬，伴随PI3K-AKT-mTOR轴激活。与神经元中α-Syn通过结合SNAP29并促进其降解的机制不同，巨噬细胞中STX17-SNAP29-VAMP8复合物表达未减少，提示细胞类型特异性。FLOT1被鉴定为连接细胞外α-Syn与巨噬细胞内PI3K-mTOR信号通路的候选膜相关介导因子。

研究结论为：FLOT1促进巨噬细胞对α-Syn的摄取，细胞外α-Syn损害自噬体-溶酶体融合，促进巨噬细胞泡沫细胞形成，最终加速动脉粥样硬化进展。PI3K或mTOR的药理学抑制，或Flot1敲低，可部分恢复α-Syn诱导的巨噬细胞自噬抑制和脂质蓄积。这些发现将FLOT1和PI3K-mTOR轴鉴定为α-Syn相关血管病理的潜在调节靶点，为动脉粥样硬化的治疗干预提供了新思路，尤其在α-Syn病理与血管疾病可能交汇的老年人群中具有潜在转化意义。