Ghrelin通过小胶质细胞SHBG/JNK1/Beclin1轴调控自噬相关信号缓解衰老相关认知障碍

《Aging Cell》：Ghrelin Alleviates Aging-Related Cognitive Impairment by Regulating Autophagy-Related Signaling via the SHBG/JNK1/Beclin1 Axis in Microglia

　　

摘要 与衰老和免疫衰老相关的认知障碍（cognitive impairment，CI）与代谢改变密切相关。小胶质细胞衰老和自噬失调被认为是这一过程的主要促成因素，但其潜在的代谢调控因子仍不清楚。本研究旨在识别CI的关键代谢调控因子并阐明其潜在机制。研究整合了人群队列分析、老年小鼠和D-半乳糖（D-galactose，D-gal）诱导的小鼠模型以及小胶质细胞模型，以研究CI的代谢调控。临床分析确定ghrelin是与CI关联最强的因子。老年小鼠和D-gal小鼠表现出CI、小胶质细胞衰老、炎症增强和ghrelin水平升高。Ghrelin治疗改善了认知功能，减轻了小胶质细胞衰老并抑制了炎症，而高剂量ghrelin诱导了生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）脱敏。性激素结合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）主要呈胞质定位，被确定为ghrelin在小胶质细胞中信号传导的潜在介导因子，其表达在ghrelin处理后下调。转录组学分析显示，ghrelin处理的小胶质细胞中自噬相关通路显著富集。Ghrelin改变了自噬相关标志物，表现为Beclin1和LC3升高以及p62降低。SHBG过表达或JNK1抑制减弱了ghrelin诱导的自噬相关标志物改变和抗衰老效应，而Beclin1过表达部分挽救了SHBG过表达引起的这些抑制效应。总之，ghrelin缓解了衰老相关CI，机制证据表明通过SHBG/JNK1/Beclin1轴调控小胶质细胞自噬相关机制可能有助于其保护作用，从而为衰老相关CI提供了潜在的治疗策略。

一、研究背景与科学问题

认知障碍（cognitive impairment，CI）是一种常见的与年龄相关的疾病，以记忆、注意力和执行功能的进行性损害为特征，严重影响患者的日常生活能力。中国拥有全球最大的老年CI人群，已成为重大公共卫生挑战。近年来，代谢紊乱日益被认识到是CI的重要促成因素，代谢综合征及其各组分与CI密切相关。作为衰老的标志性特征，代谢失调可能通过多种生物学途径促进认知衰退。

免疫衰老是指与衰老相关的免疫功能进行性下降，其特征包括对新抗原的免疫应答减弱以及慢性低度炎症（即"炎症衰老"）。在中枢神经系统中，小胶质细胞对免疫微环境的年龄相关变化尤为敏感。衰老的小胶质细胞呈现促炎表型，伴随吞噬能力受损，产生过量炎性细胞因子，加剧神经元损伤。新近证据表明，自噬受损可促进小胶质细胞的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）并加速淀粉样病理，而完整的自噬活性对维持小胶质细胞稳态和神经保护功能至关重要。然而，自噬缺陷如何促进小胶质细胞SASP及随后的CI仍不清楚。

Ghrelin是一种肠道来源的肽类激素，在认知障碍中表现出神经保护作用。临床研究报告轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）患者循环ghrelin水平升高，提示ghrelin可能是早期认知衰退的潜在生物标志物。机制上，ghrelin通过减轻氧化应激、维持线粒体功能和增强突触可塑性发挥神经保护作用。此外，ghrelin已被报道通过AMPK/ULK1/Beclin1信号通路调控自噬。然而，ghrelin是否通过自噬调控小胶质细胞免疫衰老从而缓解衰老相关CI仍不清楚。本研究旨在从行为学、分子和转录水平探讨ghrelin对衰老相关CI的作用及其潜在机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员整合了人类队列分析、老年小鼠和D-半乳糖（D-galactose，D-gal）诱导的小鼠模型以及小胶质细胞模型，系统研究了ghrelin对衰老相关CI的作用。结果表明，ghrelin给药显著改善了D-gal处理小鼠和老年小鼠的学习记忆能力，同时降低了海马中衰老标志物和促炎细胞因子的表达。机制上，ghrelin通过性激素结合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）/c-Jun N末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1）/Beclin1信号轴调控自噬，恢复小胶质细胞稳态，从而抑制SASP并减轻神经炎症。这些发现揭示了ghrelin调控小胶质细胞衰老的先前未识别的调控机制，为代谢信号、免疫衰老和神经退行性变之间的交互提供了新见解。

三、关键技术与方法

本研究采用多种关键技术方法。人群队列分析纳入257例接受全面认知评估的社区汉族成年人（≥50岁），按蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）评分分为正常认知、MCI、中度CI和重度CI四组。动物实验使用雄性C57BL/6小鼠，建立早期衰老模型（2月龄vs 9月龄）、D-gal诱导衰老模型（1000 mg/kg腹腔注射8周）及ghrelin干预模型。行为学评估采用新物体位置（NOL）测试、新物体识别（NOR）测试和Morris水迷宫（MWM）测试。分子生物学方法包括Western blot、免疫荧光染色、ELISA、RT-qPCR和免疫共沉淀（Co-IP）。此外，还运用了网络药理学分析、分子对接和RNA测序（RNA-seq）等生物信息学方法。

四、研究结果

3.1 Ghrelin失调与人类CI相关

通过对不同认知状态（正常、MCI、中度和重度CI）参与者的代谢指标分析，发现ghrelin与MoCA评分呈最强的负相关（p=0.0004），表明循环ghrelin水平越高，认知表现越差、CI严重程度越高。性别分层分析显示，女性MCI患者的ghrelin水平显著高于认知正常组，且显著高于男性MCI患者，提示ghrelin可能以性别依赖方式参与衰老相关CI。

3.2 老年和D-gal诱导小鼠的CI伴随小胶质细胞衰老和ghrelin水平升高

老年小鼠和D-gal处理小鼠在NOL、NOR和MWM测试中表现出认知功能损害。Western blot显示海马中衰老标志物p16^Ink4a、p21^Cip1和γH2AX表达上调，而Lamin B1和HMGB1下调。免疫荧光共定位证实Iba-1⁺小胶质细胞中γH2AX增加、LaminB1和HMGB1减少，表明小胶质细胞衰老促成衰老相关CI。ELISA检测显示海马中多种炎性介质（IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL10等）水平显著升高，血浆总ghrelin和酰化ghrelin水平也显著升高。

3.3 Ghrelin给药缓解D-gal诱导的小胶质细胞衰老和CI

剂量反应实验显示，高剂量ghrelin（80 μg/kg）在改善行为表现和细胞表型方面效果最显著。在D-gal诱导衰老模型和早期衰老模型中，ghrelin显著改善NOL、NOR和MWM测试表现，下调p16^Ink4a、p21^Cip1和γH2AX表达，增强LaminB1和HMGB1表达，减少Iba-1⁺小胶质细胞中共表达衰老标志物的比例，并降低海马中多种促炎细胞因子水平。

3.4 网络药理学和分子对接提示SHBG是ghrelin作用的候选介导因子

研究发现高剂量ghrelin可诱导生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）脱敏，且GHSR敲低仅部分影响ghrelin的抗衰老效应，提示其抗衰老活性主要不依赖GHSR。网络药理学分析确定了SHBG、SRC、C5AR1、KLF4和BRCA1五个核心基因。其中SHBG对ghrelin处理的响应最一致，D-gal诱导的SHBG上调被ghrelin部分逆转。免疫荧光显示SHBG主要定位于BV2细胞胞质，分子对接和Co-IP实验证实ghrelin与SHBG存在相互作用。Western blot证实ghrelin以剂量依赖方式降低海马SHBG表达。

3.5 Ghrelin通过小胶质细胞自噬相关信号调控衰老相关CI

KEGG通路富集分析发现细胞衰老和自噬相关通路显著富集。RT-qPCR显示ghrelin下调AKT1、CTSL、ERK1和LKB1表达，上调MTOR、RAF1和JNK1表达，其中JNK1变化最显著。Western blot显示ghrelin降低p62水平、增加Beclin1和LC3-II/LC3-I水平。免疫荧光证实ghrelin减少Iba-1⁺小胶质细胞中p62与γH2AX的共定位，增强p62与LaminB1的共定位。RNA-seq分析鉴定出373个上调基因和431个下调基因，GSEA分析显示ghrelin处理的小胶质细胞中自噬相关通路正向富集（NES=1.86）。

3.6 Ghrelin通过SHBG/JNK1/Beclin1轴调控自噬相关信号缓解小胶质细胞衰老

Ghrelin降低SHBG和p62水平，增强Beclin1和LC3-II/LC3-I水平。SHBG过表达部分消除了ghrelin的效应，增加p21^Cip1和γH2AX表达，降低LaminB1和HMGB1表达，同时增加p-Raf1并降低Beclin1、LC3-II/LC3-I比值和p-JNK1/JNK1比值。SHBG敲低增加JNK1磷酸化，而SHBG过表达降低JNK1磷酸化，支持JNK1位于SHBG下游。JNK1药理学抑制显著降低ghrelin处理下的Beclin1水平和LC3-II/LC3-I比值。Beclin1共过表达部分挽救了SHBG过表达对衰老相关蛋白的效应，逆转了对ghrelin介导保护的抑制。

五、讨论与结论

本研究证实ghrelin通过SHBG/JNK1/Beclin1信号轴调控自噬相关分子变化，减轻小胶质细胞衰老，从而缓解衰老相关CI。人群队列分析确定ghrelin是与CI关联最强的代谢因子。在D-gal诱导和早期衰老模型中，ghrelin改善了学习记忆、抑制了海马炎性细胞因子产生并减轻了衰老相关标志物表达。高剂量ghrelin暴露下GHSR脱敏提示SHBG可能作为ghrelin抗衰老效应的潜在非经典介导因子。

研究存在一定局限性：早期衰老模型和D-gal模型不能完全模拟人类CI的复杂病理；9月龄小鼠更接近中年或早期衰老模型而非经典晚期衰老模型；动物实验仅使用雄性小鼠，结果对雌性个体的适用性需进一步验证；小胶质细胞是否涉及AMPK或ERK等其他信号通路有待研究；ghrelin治疗的长期效应和安全性需在大动物模型和临床试验中评估。

结论：本研究确定ghrelin是衰老相关CI的新型调控因子。Ghrelin可能通过SHBG/JNK1/Beclin1通路调控自噬相关信号，改善小胶质细胞衰老，部分促成炎症抑制和认知功能改善。该研究为脑衰老的代谢调控提供了新见解，为衰老相关CI提供了潜在治疗策略。