《International Journal of Genomics》：Revealing the Diagnostic Potential of Three RHO GTPase-Related Genes in Osteoarthritis Based on Single-Cell RNA Sequencing and GEO Dataset Analysis
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专业术语翻译（摘要部分）
背景： 骨关节炎（osteoarthritis，OA）日益普遍，RHO GTPase家族成员已被证实参与OA相关的炎症过程。因此，研究人员探讨了RHO GTPase相关基因（RHO GTPase-related genes，RGPRG
专业术语翻译（摘要部分）
背景： 骨关节炎（osteoarthritis，OA）日益普遍，RHO GTPase家族成员已被证实参与OA相关的炎症过程。因此，研究人员探讨了RHO GTPase相关基因（RHO GTPase-related genes，RGPRGs）在OA中的诊断价值。
方法： OA表达数据集收集自公共数据库，而RGPRGs则从已发表文献中汇编获得。在训练队列中，研究人员首先进行差异表达分析，筛选OA样本与对照样本之间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。通过将DEG列表与RGPRG集合取交集获得RHO GTPase相关DEGs，随后采用Boruta和XGBoost算法进行特征选择。候选生物标志物进一步通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析和跨数据集表达验证进行评估。选定的生物标志物用于建立和验证人工神经网络（artificial neural network，ANN）模型，并通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和免疫浸润分析检查其生物学关联。在GSE152805中，识别出关键细胞群体，随后通过拟时序分析、细胞间通讯、通路活性和代谢分析对其进行表征。
结果： 分析共获得801个DEGs、30个候选基因、14个候选生物标志物和3个最终生物标志物。ANN在训练集中达到曲线下面积（area under the curve，AUC）0.940，在验证集中达到0.833。经Benjamini–Hochberg校正后，VAV1、STMN2和RND1分别与34、7和31条显著的KEGG通路相关，其中5条通路为三者共有（校正p < 0.05且|标准化富集分数（normalized enrichment score，NES）| > 1）。STMN2还与自然杀伤（natural killer，NK）细胞呈显著正相关（相关系数（correlation coefficient，cor）= 0.604，p < 0.01）。成纤维细胞被选为关键细胞群体，并显示出与内皮细胞的强通讯。沿成纤维细胞拟时序轨迹，RND1表达先下降、随后上升、在后期再次下降。单细胞Reactome分析进一步表明，成纤维细胞亚群之间在细胞相互作用、免疫信号传导、转录调控和代谢过程方面存在功能差异。
结论： VAV1、STMN2和RND1可作为OA可靠的诊断生物标志物，并可能为早期检测和治疗研究提供分子候选靶点。这些发现也拓展了目前对OA中RHO GTPase相关过程的认识，并支持进一步评估基于生物标志物的诊断策略。
论文解读文章
一、研究背景与意义
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性全关节疾病，以进行性关节软骨破坏和慢性疼痛为特征。其全球发病率正迅速上升，预计到2040年患者人数将翻一番。目前OA的病因和核心机制尚未完全阐明，临床干预主要依赖对症治疗，只能暂时缓解疼痛等症状而无法根治。当保守治疗失败时，常采用关节腔内注射或关节置换手术等更具侵入性的干预措施，但这些方法存在并发症风险且可能仅提供暂时缓解。因此，进一步阐明OA的病理机制、寻找新的治疗靶点和早期诊断生物标志物，对于改善OA的临床管理至关重要。
RHO GTPase家族是小GTPase超家族的核心组成部分，精确调控细胞骨架重组、增殖、凋亡和炎症因子分泌等过程。其异常激活的信号通路已被证实与多种退行性和炎症性疾病密切相关。在OA病理微环境中，软骨细胞去分化、凋亡和软骨基质降解是疾病进展的核心，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在细胞外基质分解中发挥关键作用。RHO GTPase家族成员不仅能通过调控软骨细胞骨架影响细胞外基质合成与降解的平衡，还能参与滑膜成纤维细胞活化和炎症因子释放，从而加剧关节炎症。然而，RGPRGs在OA中的诊断价值和具体机制仍不清楚，需要通过整合生物信息学和单细胞方法进行系统阐明。
单细胞RNA测序能够在单细胞分辨率下进行基因表达谱分析，直接反映不同细胞间的功能异质性，有助于识别疾病相关的差异特征并解析其分子机制。将单细胞表达信息与RGPRGs等功能基因集整合，为精准识别OA中的关键细胞靶点提供了新途径。
二、研究设计与主要方法
研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）收集OA数据集，其中GSE55235（GPL96平台，10例OA和10例正常滑膜样本）作为训练集，GSE12021（GPL96平台，10例OA和9例正常样本）作为独立外部验证集，单细胞数据集GSE152805（GPL20301平台）包含3例OA滑膜组织样本。同时从文献中汇编获得733个RGPRGs。主要关键技术方法包括：利用limma包进行差异表达分析；采用Boruta和XGBoost两种机器学习算法筛选候选生物标志物；通过受试者工作特征（ROC）分析和跨数据集表达验证评估候选标志物诊断性能；构建人工神经网络（ANN）模型验证标志物区分能力；通过基因集富集分析（GSEA）和单样本基因集富集分析（ssGSEA）免疫浸润分析探究生物学关联；利用Seurat处理单细胞数据并进行聚类注释；通过CellChat进行细胞通讯分析；利用Monocle进行拟时序分析；通过ReactomeGSA、UCell和scMetabolism评估通路活性和代谢特征。
三、研究结果
3.1 OA中RHO GTPase相关候选基因的鉴定与分析
在GSE55235训练集中，差异表达分析鉴定出801个DEGs，其中490个上调、311个下调。将这些DEGs与RGPRG集合取交集，获得30个候选基因。基因本体（GO）富集分析显示候选基因主要参与细胞形态调控和肌动蛋白丝相关过程；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示显著富集于趋化因子信号通路和白细胞跨内皮迁移等通路。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示30个候选基因之间存在146个蛋白水平相互作用。
3.2 基于机器学习的OA临床诊断生物标志物筛选
Boruta算法保留24个候选生物标志物，XGBoost算法保留16个候选生物标志物，两者取交集获得14个候选生物标志物。ROC评估确定VAV1、STMN2和RND1为三个关键生物标志物，其中VAV1在训练集AUC为0.960、验证集为0.789。表达验证显示VAV1和STMN2在OA样本中显著高表达，而RND1在对照组中表达更高。
3.3 ANN模型的构建与ROC曲线评估
利用三个生物标志物构建的ANN模型在训练集中AUC为0.940，在验证集中AUC为0.833，显示出良好的判别性能。
3.4 生物标志物的GSEA分析
经Benjamini–Hochberg校正后，VAV1、STMN2和RND1分别与34、7和31条显著KEGG通路相关，其中溶酶体、剪接体、细胞黏附分子、Fc gamma R介导的吞噬作用和脂肪细胞因子信号通路为三者共有。
3.5 免疫细胞浸润分析
通过ssGSEA评估28种免疫细胞类型的丰度，14种免疫细胞类型在疾病组和对照组间存在显著差异。VAV1与髓源性抑制细胞（MDSCs）、STMN2与自然杀伤（NK）细胞、RND1与2型辅助细胞分别呈显著相关。
3.6 分子调控网络构建
构建了mRNA-miRNA和mRNA-转录因子（TF）相互作用网络，预测VAV1、STMN2和RND1分别与5、156和57个miRNA及10、7和12个TFs存在潜在相互作用。转录因子FOXC1被预测对三个生物标志物均具有潜在调控作用。GeneMANIA网络分析显示STMN2相关连接富集于神经元突起发育调控、微管聚合或解聚调控等过程。
3.7 靶向生物标志物的潜在药物预测与分子对接
药物预测发现4种靶向VAV1、11种靶向RND1、4种靶向STMN2的潜在药物，其中anisomycin可同时靶向VAV1和RND1。分子对接显示VAV1与6-巯基嘌呤（?9.3 kcal/mol）、STMN2与tolnaftate（?7.0 kcal/mol）、RND1与primaquine（?6.9 kcal/mol）之间具有良好结合亲和力。
3.8 OA关键细胞的鉴定
单细胞数据集经质量控制后保留10,293个细胞，UMAP降维聚类获得12个簇，注释为成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞、肥大细胞和B细胞八种细胞类型。成纤维细胞在OA细胞中占比显著高于其他细胞类型，且三个生物标志物在成纤维细胞中均有表达，因此将成纤维细胞确定为关键细胞群体。
3.9 细胞间相互作用分析
细胞通讯分析显示成纤维细胞-内皮细胞之间的相互作用数量和强度较高，成纤维细胞与其他细胞类型的通讯主要涉及MIF-(CD74+CD44)通路。
3.10 拟时序和轨迹分析
成纤维细胞被分为8个亚群，包含9个分化状态，其中亚群1和3处于终末分化阶段。沿拟时序轨迹，RND1表达先下降、中期上升、后期再次下降；STMN2早期急剧下降；VAV1保持稳定。
3.11 通路活性和代谢通路特征
ReactomeGSA分析评估了1,740条Reactome通路，去冗余后保留687条代表性通路，Top 10通路涵盖细胞间相互作用、炎症和先天免疫信号传导、转录调控和代谢过程。UCell分析显示Top 20 Hallmark和KEGG通路主要涉及上皮-间质转化、细胞外基质相互作用、氧化磷酸化和活性氧（ROS）反应、mTORC1信号、血管生成及多种代谢过程。代谢分析显示亚群3在大多数通路中活性较高，亚群4和5活性较低，α-亚麻酸代谢和亚油酸代谢在大多数亚群中高度富集。
四、讨论总结与研究结论
研究人员通过整合生物信息学和单细胞测序分析，确定了VAV1、STMN2和RND1三个具有良好诊断性能的RHO GTPase相关生物标志物。VAV1作为RHO GTPase的关键上游激活因子，其高表达可能反映关节组织对损伤的适应性调控反应；STMN2作为微管解聚蛋白，其高表达可能放大微管失衡从而促进炎症细胞浸润和细胞外基质降解；RND1作为组成性激活的RHO GTPase成员，其低表达可能破坏正常的RHO GTPase-RND1调控网络，导致炎症控制不足和软骨修复受损。三个生物标志物在成纤维细胞中高表达，成纤维细胞在OA中显著增多且与内皮细胞存在强通讯，提示其可能通过RHO GTPase信号加剧OA关节炎症和组织退变。研究还发现VAV1与MDSCs呈正相关，可能形成炎症放大循环。成纤维细胞亚群间存在显著的功能异质性，涉及细胞相互作用、免疫信号、转录调控和代谢过程。研究也存在样本量有限、基于公共数据库的回顾性分析等局限性，未来需要通过多中心前瞻性队列和体内外实验进一步验证。综合而言，VAV1、STMN2和RND1可作为OA早期诊断的可靠生物标志物，为早期检测和治疗研究提供分子候选靶点，拓展了对OA中RHO GTPase相关过程的认识。
