《Developmental Neurobiology》：Molecular and Proteomic Profiling of Human Cerebral Organoid?Derived Small Extracellular Vesicles
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类器官是由祖细胞或多能干细胞在体外条件下自组织形成的三维（3D）结构。在培养过程中，这些组织会向其微环境分泌具有功能活性的生物活性分子——小细胞外囊泡（sEVs）。本研究将诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官（COs）在三种培养条件（静态培养、轨道摇床培养
类器官是由祖细胞或多能干细胞在体外条件下自组织形成的三维（3D）结构。在培养过程中，这些组织会向其微环境分泌具有功能活性的生物活性分子——小细胞外囊泡（sEVs）。本研究将诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官（COs）在三种培养条件（静态培养、轨道摇床培养以及一种新型动态器官芯片平台）下进行为期30天的成熟分化，以确定培养动力学如何塑造类器官发育及细胞外囊泡（EV）特征。转录组学分析揭示了强烈的、培养条件特异性的基因表达调控，而EV蛋白质组学显示各条件在早期成熟阶段具有相似的谱型，但在后期阶段出现显著分化，反映了细胞维持、应激反应及组织特异性成熟通路方面的差异。此外，来自所有条件的sEVs均降低了U87胶质母细胞瘤细胞的活力和迁移能力，其中以轨道摇床培养条件来源的sEVs效果最为显著。这些发现表明，类器官培养微环境显著影响发育轨迹及所分泌EV的生物活性。
论文解读
一、研究背景与目的
脑类器官（COs）是由多能干细胞（PSCs）在体外自组织形成的三维组织结构，能够在一定程度上重现大脑的器官发生过程及相应生理特性，包括特定细胞类型和脑区的形成。然而，脑类器官培养面临缺乏血管化导致氧和营养扩散受限、易形成坏死核心、长期体外成熟阶段受限等瓶颈。为此，生物工程策略如搅拌瓶、轨道摇床、微流控平台、微型旋转生物反应器等被引入以改善类器官培养条件。近年来，器官芯片平台凭借对微环境的高度可控性，在提高标准化和可重复性方面展现出优势。
类器官能够向微环境分泌细胞外囊泡（EVs）——一种包含脂质、核酸、代谢物等功能性生物活性分子的细胞间通讯介质。尽管脑类器官在神经系统疾病机制研究和药物筛选中具有重要价值，但脑类器官来源EVs在再生医学中的潜在应用仍 largely 未被探索。已有研究表明类器官来源EVs在神经发生、神经保护及疾病进展中发挥作用，但关于脑类器官培养条件对EV分泌特征的影响尚未被系统阐明。本研究旨在探究不同培养条件如何影响脑类器官的发育轨迹及其分泌的小细胞外囊泡（sEVs）的分子特征和生物活性。
二、主要技术方法
研究人员将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化来源的脑类器官在三种培养条件下成熟培养30天：静态培养、85 rpm轨道摇床动态培养，以及流速为0.35 μL/min的新型动态器官芯片平台。研究采用了以下关键技术手段：利用COMSOL Multiphysics进行微流控芯片的流体动力学和剪切应力模拟分析；通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜对类器官进行组织学表征；采用差速超速离心法分离sEVs；运用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、扫描电子显微镜（SEM）和蛋白质印迹法（Western blotting）对sEVs进行表征；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行sEV蛋白质组学分析；利用RNA测序（RNA-seq）进行转录组学分析；通过MTT实验、划痕实验和悬滴法球体形成实验评估sEVs对U87胶质母细胞瘤细胞的生物活性影响。
三、研究结果
器官芯片平台的构建与表征：研究人员设计并制造了一种聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材质的微流控芯片，其通道在接近直径11 mm的类器官腔室时逐渐加宽，以降低流速和剪切应力。COMSOL模拟显示，类器官暴露于0.05–0.15 μm/s的均匀分布流速中，腔室内剪切应力为5–10×10?? mPa，介于静态和轨道摇床条件之间，实现了预期的中等动态微环境。
脑类器官的生成与表征：H&E染色显示轨道摇床和器官芯片条件下的类器官中存在神经玫瑰花结结构，表明神经祖细胞（NPCs）的增殖。TUJ1神经元标记物在三种条件下均广泛表达，静态条件下呈现出更清晰的脑室区样分层结构。YAP/TAZ在轨道摇床条件下表现出更多核定位，而静态和芯片条件下以胞质定位为主。Calretinin阳性细胞在三种条件下呈现不同形态：轨道摇床组以圆形形态为主，静态和芯片组呈现极性神经元样形态，芯片组calretinin阳性细胞数量最多。FOXG1前脑标记物在所有组织中均有表达，TTR脉络丛上皮标记物在各组间表达面积相似。所有条件下类器官中央区域均存在坏死核心样区域。
跨条件的转录组差异：主成分分析（PCA）显示不同培养条件的类器官转录组呈现明显的条件特异性分离。差异表达基因（DEGs）分析显示，器官芯片与轨道摇床之间的DEGs数量最多（5110个），静态与轨道摇床之间为1914个，器官芯片与静态之间最少（911个）。微流控环境独特富集了核小体组装和染色质组织通路，提示向终末神经元分化程序的表观遗传重组。轨道摇床与静态条件比较中，EGR1和OLIG2上调；轨道摇床与芯片比较中，ISL1上调。轨道摇床条件表现出缺氧特征，HIF-1α靶基因（SLC2A1、HK2、CA9、MIR210）显著上调。静态培养表现出细胞外基质（ECM）机械感知轴的协调上调，包括纤维状胶原（COL1A1、COL3A1）和胶原受体DDR2，并与胶质发生标志物（GFAP、SOX10）相关；而芯片平台则有利于神经谱系定型基因（DLX1、WNT3A）的表达。
小细胞外囊泡的特征分析：NTA分析显示静态条件下sEVs主要直径为155和209 nm，轨道摇床条件下为119、137和182 nm，芯片条件下为129 nm。SEM图像确认了10–150 nm的球形形态。Western blotting验证了sEVs标志物Alix的富集和非sEV标志物Calnexin的低丰度。PKH67标记的sEVs在24小时内被U87胶质母细胞瘤细胞有效内化。在三个时间点中，芯片条件的EV浓度整体低于其他条件，但仅在第一个时间点达到统计学显著性。
条件特异性蛋白质组学分析：早期阶段（第12–15天），三种条件的sEV蛋白质组学谱相似，均富集中间丝组织和上皮细胞分化等生物过程，反映早期外胚层分化模式。静态培养在后期（第24–27天）富集端粒维持和Cajal体相关过程，表明在低机械动力学条件下细胞增殖活跃。轨道摇床条件在后期保留组织分化和维持相关术语，并出现伴侣介导的蛋白复合物组装，同时伴随线粒体伴侣HSP60的出现，提示高剪切条件下的线粒体应激。芯片条件表现出铁转运蛋白（TF）评分的逐步增加，反映向终末神经分化和稳定代谢状态的过渡。总体而言，动态培养条件下的sEV蛋白质组比静态培养更早呈现成熟特征。
sEVs对胶质母细胞瘤的生物活性：MTT实验显示，与未处理对照相比，三种条件来源的sEVs均显著降低U87细胞活力，其中轨道摇床来源的sEVs抑制作用最强。Ki67/DAPI免疫荧光分析显示芯片sEV处理组的Manders系数低于其他处理组。划痕实验表明轨道摇床来源的sEVs对U87细胞迁移的抑制能力最强。悬滴球体形成实验中，sEVs处理组的球体直径显著小于对照组，表明sEVs促进了细胞间更紧密的组织排列。
四、结论
本研究证明培养微环境和机械转导信号显著影响脑类器官来源sEVs的特征。研究结果表明，不仅分化和培养方案，微生理培养条件也应被纳入标准化sEV生成的考量因素。脑类器官来源的sEVs在胶质母细胞瘤细胞中展现出抑制活力和迁移的能力，提示其在神经系统疾病治疗中的潜在应用价值。
