《Stem Cells International》：The Role and Mechanism of Hair Follicle Neural Crest Stem Cells and Their Small Extracellular Vesicles in Repair of Peripheral Nerve Injury
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外周神经损伤（PNI）由于当前治疗策略疗效有限，仍是重要临床挑战。自体神经移植是修复PNI的金标准，但受限于供区并发症；替代方法包括细胞治疗、神经导管、基因治疗和电刺激，但仍存在免疫排斥和伦理争议。然而，毛囊神经嵴干细胞（hfNCSCs）作为一种起源于胚胎神经
外周神经损伤（PNI）由于当前治疗策略疗效有限，仍是重要临床挑战。自体神经移植是修复PNI的金标准，但受限于供区并发症；替代方法包括细胞治疗、神经导管、基因治疗和电刺激，但仍存在免疫排斥和伦理争议。然而，毛囊神经嵴干细胞（hfNCSCs）作为一种起源于胚胎神经嵴的多能细胞群体，已成为有前景的候选细胞。hfNCSCs具有高分化潜能、伦理可接受性和可获取性，在轴突再生和功能恢复方面具有显著优势。同时，干细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）因其低免疫原性、非致瘤性和储存便利而日益受到关注。临床前研究强调其在调节神经炎症、增强施万细胞（SC）活性和促进神经修复方面的协同潜力。本综述总结hfNCSCs和sEVs用于PNI修复的最新进展，重点聚焦分子机制和转化应用。研究人员进一步讨论hfNCSCs-sEVs作为神经再生中无细胞治疗策略的挑战和未来方向。
1. 背景（Background）
外周神经损伤（PNI）常由机械创伤、医源性干预或肿瘤切除等疾病并发症引起，导致运动与感觉功能部分或完全受损，表现为持续麻木、无力甚至瘫痪，并常伴神经病理性疼痛，显著影响患者生活质量。病理上，PNI引起近端神经段逆行性轴突变性以及远端残端的沃勒变性（Wallerian degeneration）。施万细胞（SC）作为外周神经系统主要胶质细胞，在脱髓鞘后去分化，形成Büngner带以引导轴突再生长，并分泌神经营养因子（NTFs）。然而衰老SC可出现应激颗粒稳态失衡，损害其支持轴突再生的功能；部分重编程虽可逆转此现象，但自然衰老条件下该缺陷持续存在，限制再生效率。由于损伤外周神经内在再生能力有限，需有效临床干预。自体神经移植是桥接神经缺损的临床金标准，但受供体有限、供区去神经支配和移植物-宿主不匹配限制。生物工程神经导管和组织工程构建物逐渐应用，其中种子细胞尤其是干细胞因能分化为神经谱系、提供合适微环境并通过分泌NTFs促进轴突再生而关键。成体干细胞（ASCs）具自我更新和非对称分裂优势，但临床转化受分离、免疫抑制潜力和致瘤风险阻碍。近年，毛囊隆突部驻留的毛囊神经嵴干细胞（hfNCSCs）成为有前景候选。其起源于外胚层神经嵴，具卓越多能性，可分化为神经元、胶质细胞和施万样细胞。重要的是，自体来源减少伦理顾虑和免疫排斥，促进轴突再生和髓鞘化以修复PNI。与此同时，干细胞衍生的小细胞外囊泡（sEVs）作为无细胞替代物受关注。根据MISEV 2023指南，sEVs是富集miRNAs、蛋白质和脂质的纳米囊泡，通过调节神经炎症、促进SC迁移和刺激血管生成介导细胞间通讯。干细胞来源sEVs（SC-sEVs）可协同规避直接细胞移植风险并增强治疗效果。综上，hfNCSCs及其衍生sEVs推进PNI修复有重要前景。本综述综合hfNCSCs及其sEVs用于PNI修复的临床前进展，重点分子机制和转化应用，并讨论hfNCSCs-sEVs作为无细胞治疗策略的挑战和未来方向。
2. hfNCSCs
2.1 生物学特征（Biological Characteristics of hfNCSCs）
hfNCSCs是起源于胚胎神经嵴的多能干细胞群。2004年Sieber-Blum等首次报道在成年哺乳动物中发现hfNCSCs，在小鼠毛囊隆突部鉴定到神经嵴衍生干细胞。hfNCSCs表达神经祖细胞标志物Nestin、Sox10，并保留分化为神经元、胶质细胞、骨细胞、黑素细胞、平滑肌细胞和SC等多种细胞类型的能力。hfNCSCs在可获取性、分化效率和冻存稳定性方面具优势。与常规神经干细胞（NSCs）相比，hfNCSCs可从自体毛囊无创获取，避免伦理问题并支持大规模分离。与骨髓间充质干细胞（BMSCs）等ASCs相比，hfNCSCs神经分化率更优。冻存毛囊在复苏后保留hfNCSC活力和多能性，利于长期储存和临床应用。这些特性结合其在临床前模型中促进轴突生长和功能恢复的能力，使其成为PNI修复有前景候选。然而，明确的转化瓶颈是每个毛囊绝对细胞产量显著低于骨髓或脂肪组织。低起始细胞数需大量体外扩增以产生足够hfNCSCs或其sEVs，对可扩展性和成本效益构成挑战。为比较用于外周神经再生的关键干细胞类型，包括可获取性、分化潜能、分泌组和产量，研究总结了hfNCSCs和其他常研究干细胞特征。hfNCSCs每个体毛囊（P0）典型原代产量约1.65 × 10
5个细胞；BMSCs每mL抽吸物为2885 ± 1716 CFU-f；ADSCs每mL吸脂物约185 × 10
3 SVF细胞；UCMSCs每样本6.5 × 10
6 ± 0.8细胞；AFMSCs每样本5.8 × 10
6 ± 0.6细胞；DPSCs每牙>1 × 10
6细胞。绝对细胞产量随单位组织变化大；hfNCSCs每次分离通常少于BMSCs或ADSCs。
2.2 hfNCSCs在PNI修复中的机制（Mechanism of hfNCSCs in PNI Repair）
hfNCSCs可能通过两种协同机制促进PNI修复：直接分化和旁分泌调节。
2.2.1 直接分化为功能细胞（Direct Differentiation Into Functional Cells）
hfNCSCs分化为SC和神经元，直接重建受损神经回路。Lin等使用hfNCSCs种子细胞的无细胞神经移植物桥接大鼠4 cm长坐骨神经缺损，实现向SC的靶向分化和与自体移植相当的功能恢复。Sakaue和Sieber-Blum建立详细实验方案，证明来源于毛囊的人表皮神经嵴干细胞可在体外高效快速诱导分化为高纯度SC。诱导细胞持续表达特定SC标志物并分泌与神经修复相关的关键NTFs。
2.2.2 旁分泌再生介质（Paracrine Secretion of Regenerative Mediators）
hfNCSCs分泌NTFs如脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和神经营养因子-3（NT3），对神经元存活和功能必需，刺激神经发生和多个下行轴突束再生长。Li等揭示在大鼠10 mm坐骨神经缺损桥接后7天，移植从大鼠触须毛囊分离的表皮神经嵴干细胞显著降低促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）表达，并显著增强抗炎细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）表达，与DMEM对照组相比（p < 0.05）。这与假设一致：移植hfNCSCs通过将平衡从促炎向抗炎介质转变来调节局部炎症微环境，从而创造促进神经修复的再生微环境。此外，hfNCSCs释放的金属蛋白酶（如基质金属肽酶-2、基质金属肽酶-3和MMP-14）可能积极参与瘢痕形成期间细胞外基质重塑，从而可能降低瘢痕屏障效应并促进瘢痕溶解和轴突寻路。这些双重机制——结构整合和分子信号——可能使hfNCSCs同时应对PNI形态和功能缺陷。
3. SC-sEVs
3.1 sEVs生物学特征（Biological Characteristics of sEVs）
sEVs是纳米级囊泡，直径通常小于200 nm，并存在特定蛋白标志物，包括跨膜四跨膜蛋白（如CD63和CD81）和参与囊泡形成的胞质蛋白（如TSG101）。这些特征与内体起源一致，sEVs常通过多囊体途径释放。然而确定内体生物发生证据需实验证明，如内体标志物免疫亲和捕获或密度梯度纯化，而多数引用研究未进行。因此依据MISEV 2023指南，本综述使用中性术语“sEVs”以保持术语精确。为有效利用sEVs治疗，从生物样品中精确分离至关重要。当前主要分离方法包括超速离心、尺寸排阻色谱、沉淀试剂盒、免疫亲和捕获、超滤、基于微流体的分离和密度梯度离心，各有优势和局限。干细胞来源sEVs（SC-sEVs）已成为比全细胞治疗更安全和稳定的替代物，广泛用于研究。与直接干细胞移植相比，SC-sEVs有若干优势。第一，缺乏复制性DNA，消除致瘤性、心律失常和微血管闭塞风险。第二，sEV膜上主要组织相容性复合体（MHC）分子表达极低，减少免疫排斥。第三，SC-sEVs在?20°C长期储存中保留生物活性，无需潜在毒性冷冻保护剂，大大简化制造和分销。值得注意的是，MSC-sEVs的活力和效力在储存期间无需监测和维持。最后，SC-sEVs不受某些干细胞来源伦理顾虑限制。
3.2 SC-sEVs在PNI修复中的机制（Mechanism of SC-sEVs in PNI Repair）
SC-sEVs通过多层面机制促进外周神经再生，靶向损伤微环境的细胞和分子组分。MSC-sEVs可激活不同信号通路，介导轴突生长和髓鞘再生，调节神经炎症并运输NTFs，从而帮助PNI修复。
3.2.1 轴突生长和髓鞘再生（Axonal Growth and Remyelination）
研究人员证明脂肪来源干细胞（ADSCs）sEVs中存在神经生长因子，如BDNF、IGF-1、NGF、FGF-1和GDNF，提示sEVs在体内增强轴突再生的可能机制。牙龈MSC-sEVs强劲上调多个修复SC相关基因表达，如GFAP、c-JUN、Notch1和SOX2，诱导促再生表型，增强髓鞘化和Büngner带形成。
3.2.2 免疫调节和炎症消退（Immunomodulation and Inflammation Resolution）
来自脂多糖（LPS）预处理的MSCs的sEVs被揭示通过转运TNF刺激基因-6（TSG-6）使NF-κB/NLRP3信号轴失活，促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化，为周围神经修复提供潜在治疗途径。sEV衍生miRNAs（如miR-23a和miR-125b）抑制NF-κB信号，可能通过Toll样受体/核因子κB信号通路，减轻神经炎症并预防继发性损伤。
3.2.3 细胞外基质重塑（Extracellular Matrix Remodeling）
sEV衍生CD73诱导AKT和ERK磷酸化，并激活靶细胞如软骨细胞中的AKT/ERK通路，促进软骨细胞增殖和基质合成以支持神经支架完整性。
3.2.4 血管生成和微环境重建（Angiogenesis and Microenvironment Reconstruction）
近期研究强调SC-sEVs的促血管生成潜力，其对重建损伤神经血管龛至关重要。SC-sEVs富集促血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF），以及血管生成相关miRNAs，共同刺激内皮细胞增殖和迁移。例如，研究证明ADSC-sEVs中的miR-181b-5p通过靶向抑制TRPM7促进脑微血管内皮细胞（BMECs）血管生成，从而上调HIF-1α和VEGF蛋白表达。尽管有这些进展，来源特异性变异和标准化挑战方面仍存关键空白。与MSC-sEVs相比，神经嵴SC-sEVs（如hfNCSCs-sEVs）研究不足，尽管其潜在神经谱系特异性。分离方法（如超速离心与尺寸排阻色谱）和定量指标缺乏共识，阻碍临床转化。
4. hfNCSCs-sEVs在PNI修复中的作用和机制（Role and Mechanism of hfNCSCs-sEVs in PNI Repair）
hfNCSCs-sEVs通过超速离心从条件培养基中分离，协同结合干细胞再生益处与sEVs安全性。分离方案通常包括顺序离心去除细胞和碎片，随后以高g力（如120,000 × g）差速超速离心沉淀sEVs，并通过洗涤步骤最终纯化。这产生保留生物活性货物的纳米囊泡制剂。通过规避细胞移植相关风险（如免疫排斥和致瘤性）并利用纳米结构穿透生物屏障，hfNCSCs-sEVs成为双功能治疗剂。它们通过两种主要机制协调神经修复：miRNA介导的细胞间通讯和NTF递送，具有显著临床潜力。
4.1 增强神经束膜细胞增殖和迁移（Enhancing Perineurial Cell Proliferation and Migration）
神经束膜是环绕神经束的保护鞘，在维持血-神经屏障和启动损伤修复中起关键作用。PNI后，神经束膜细胞快速迁移至损伤部位，形成引导轴突再生的细胞桥。hfNCSCs-sEVs直接增强此过程。研究表明，hfNCSCs-sEVs促进神经束膜细胞增殖，低浓度早期发挥作用，较高浓度（20和50 μg/mL）后期影响更明显（p < 0.05）。共培养后，迁移至hfNCSCs-sEVs孔的神经束膜细胞数多于对照孔（p < 0.05）。随hfNCSCs-sEVs浓度增加，迁移神经束膜细胞数具统计学显著增加（p < 0.05）。这些发现提示hfNCSCs-sEVs加速神经束膜桥形成，促进神经再生的微环境支持。机制上，近期研究进一步证明hfNCSCs-sEVs通过TGF-β/SMAD/HAS2信号通路促进神经束膜细胞增殖和迁移，为这些囊泡如何协调PNI后早期细胞反应提供新机制见解。
4.2 调节SC功能和神经营养信号（Modulating SC Function and Neurotrophic Signaling）
虽然神经束膜细胞创建初始引导支架，SC是直接支持轴突再生和髓鞘化的主要胶质细胞。hfNCSCs-sEVs也对SC发挥强营养作用。共培养后，hfNCSCs-sEVs在体外被内化到SC中，随后加速SC增殖和迁移，并增加SC的NTF（如BDNF和NGF）表达。在大鼠面神经缺损模型中，负载hfNCSCs-sEVs的无细胞神经同种移植物（ANAs）实现与自体移植相当的髓鞘厚度和运动功能恢复，优于仅ANA对照。机制上，hfNCSCs-sEVs富集神经特异性miRNAs，尤其是miR-214-3p，占sEV衍生miRNA总含量近25%。靶标预测分析提示这些miRNA调控的基因参与生长和迁移等细胞过程，并与神经再生相关通路如突触囊泡循环、Notch信号和mTOR信号相关。然而必须强调，该证据仅为相关性。推断机制基于计算靶标预测，未经实验验证。此外，miR-214-3p常见于其他干细胞类型如UCMSCs来源sEVs，提出其在hfNCSCs-sEVs中富集是独特功能效应物还是亲本细胞表达谱导致的被动丰度偏倚的问题。因此因果关系尚待建立，miR-214-3p通过Notch/mTOR通路驱动神经再生的假设需用功能丧失（如基于antagomir抑制或CRISPR介导基因敲除）或功能获得方法在适当体内模型严格检验。尽管有上述有前景发现，仍存关键知识空白。miR-214-3p是主导效应物还是与其他miRNAs（如miR-21和miR-23）协同尚不清楚。hfNCSCs-sEVs与MSC-sEVs相比展现不同miRNA谱，但其在PNI修复中的功能优势缺乏直接验证。hfNCSCs-sEVs生产、剂量和递送途径（如神经内与全身）的标准化方案亟需推进该领域。
5. 转化空白、挑战和未来方向（Translational Gaps, Challenges, and Future Directions）
目前hfNCSCs-sEVs的体内证据虽有前景，但限于小样本年轻大鼠急性面神经损伤的啮齿类研究；其他可用研究探讨体外神经束膜细胞效应。慢性神经损伤模型无体内数据。慢性神经损伤不仅是急性损伤延长；通常涉及延迟修复、老龄动物或合并症如缺血、持续炎症或代谢紊乱，显著改变再生微环境（如SC衰老、持续神经炎症和胶质瘢痕形成），而急性横断模型未再现。相比之下，MSC-sEVs已在非神经慢性组织缺损（如皮肤、心肌和肌腱）的大动物模型中显示治疗疗效，但聚焦文献检索显示评估SC-sEVs在临界长度慢性外周神经缺损大动物模型中的研究显著缺乏。因此hfNCSCs-sEVs的转化空白尤为突出：既缺乏啮齿类慢性神经损伤数据，也缺乏任何大动物先例。除证据空白外，若干基本挑战持续存在。hfNCSCs-sEVs与内源性修复通路（如mTOR/Notch信号）的机制相互作用仍定义不清；尽管miR-214-3p在hfNCSCs-sEVs中高度富集并预测靶向这些通路基因，因果关系尚未通过功能丧失或功能获得实验建立。sEV分离、定量和递送的标准化方案缺乏，对最佳方法（如超速离心与SEC）、质量控制指标或给药途径（神经内与全身）无共识。此外，直接比较评估hfNCSCs-sEVs与其他SC-sEVs如MSC-sEVs的研究稀缺，难以确定hfNCSCs-sEVs是否为周围神经修复提供独特优势。为弥合双重空白，需分步研究议程。第一，应在临床相关啮齿类慢性神经缺损模型如延迟神经修复、老龄大鼠或合并代谢疾病模型中建立疗效。第二，应在大动物慢性神经损伤模型中验证安全性和功能结局。第三，必须制定sEV分离、表征和递送的标准化方案，包括工程化sEVs与靶向配体或缓释生物材料如纤维蛋白水凝胶。最后，应启动I期试验评估人类患者安全性、最佳剂量（如10
10 particles/cm神经缺损）和功能结局。
6. 结论（Conclusions）
PNI仍是重大临床挑战，需要创新治疗策略以克服当前治疗局限。hfNCSCs及其sEVs已成为PNI修复有前景候选，结合多能性、伦理可获取性和降低免疫原性优势。同时，hfNCSCs-sEVs提供无细胞替代方案，利用其miRNAs、蛋白质和信号分子货物促进神经束膜细胞迁移、SC激活和细胞外基质重塑。研究强调hfNCSCs-sEVs在桥接神经缺损和恢复运动功能方面的疗效，可与自体移植结局相媲美。然而关键挑战持续存在，包括需要标准化sEV分离和表征方案、关键通路机制阐明以及人类试验安全性和可扩展性验证。未来研究应优先完善机制、靶向递送策略以及通过分阶段试验的临床转化。通过解决这些空白，hfNCSCs-sEVs可能提供安全、有效且伦理可行的解决方案，以恢复神经功能并改善患者结局。
