粪菌移植通过调控TLR4/NF-κB信号通路减轻APP/PS1小鼠阿尔茨海默病病理与肠-脑炎症

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Fecal Microbiota Transplantation Protects APP/PS1 Mice via the TLR4/NF-κB Signaling Pathway

　　

背景：阿尔茨海默病（AD）是一种常见的神经退行性疾病，与全身性和神经炎症激活相关。AD中肠道菌群破坏已被明确。作为一种恢复肠道菌群失调的策略，粪菌移植（FMT）可能对AD具有治疗益处。方法：为探究潜在机制，研究人员饲养APP/PS1小鼠，并分析不同年龄的肠道菌群组成。研究人员对APP/PS1小鼠给予为期6个月来自野生型（WT）小鼠的健康肠道菌群，以评估FMT对AD病理的保护作用。结果：在9月龄时，APP/PS1小鼠表现出拟杆菌属（Bacteroides）丰度增加和厚壁菌门（Firmicutes）比例降低。FMT治疗显著减少脑淀粉样斑块沉积并抑制小胶质细胞激活。此外，在结肠和皮层中观察到的Toll样受体4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）表达升高被FMT显著减弱。结论：肠道菌群随衰老发生变化，这些改变与沿肠-脑轴增强的炎症相关。FMT是减轻AD病理的有前景方法，其效应可能由调节TLR4/NF-κB通路介导。

研究背景方面，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，临床表现为记忆丧失和认知障碍，随老龄人口增长带来沉重社会负担。散发性AD病因尚未完全阐明，有效治疗策略仍缺乏。衰老伴随炎症衰老（inflammaging），即持续性免疫稳态失衡导致轻度但持久的炎症激活，并影响作为中枢神经系统（central nervous system，CNS）固有免疫守卫者的小胶质细胞（microglia），使其进入“启动”表型。神经炎症被认为是AD发病核心特征，并与认知下降轨迹相关。近年来，肠-脑轴（gut–brain axis）在调节神经炎症和AD风险中的作用受到重视，AD患者和动物模型存在肠道菌群（gut microbiota）组成和丰度改变。肠道菌群失调可导致肠屏障渗漏，使脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）进入体循环，进而可能破坏血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）并促进神经炎症。Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）在AD患者尸检脑内淀粉样斑块附近小胶质细胞上上调，既可识别LPS，也可识别聚集的淀粉样β（amyloid-β，Aβ）肽，从而触发小胶质细胞激活和炎症级联。基于肠道微生物参与调节全身免疫和神经炎症，粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）作为恢复肠道稳态的策略受到关注，但其对TLR4介导神经炎症的作用尚未完全阐明。因此，研究人员提出TLR4信号是AD中肠道菌群失调触发神经炎症反应的关键介质，FMT通过恢复健康微生物生态系统缓解该反应。

研究人员开展了长期FMT干预研究：雄性APPswe/PSEN1dE9转基因（APP/PS1）小鼠和 nontransgenic 野生型（wild-type，WT）同窝小鼠购自 Changzhou Cavens Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（中国常州）。第一队列用于纵向肠道菌群分析，分别在3、6、9月龄收集粪便，n=6/基因型；第二队列在3月龄将APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1对照组和APP/PS1-FMT组，n=6/组，年龄匹配WT小鼠n=6作为健康对照。FMT供体为16只3月龄WT同窝小鼠，与受体分开饲养；研究人员自3月龄起每两天给予APP/PS1-FMT组200 μL微生物悬液灌胃，持续6个月，对照组给予等体积无菌PBS加20%甘油。主要关键技术包括：16S rDNA V3–V4区扩增子测序及QIIME2、DADA2、LEfSe等生物信息学分析；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测脑Aβ₄₀、Aβ₄₂及血清细胞因子；Western blotting检测TLR4、NF-κB；Congo-red染色评估脑淀粉样斑块；免疫荧光检测Iba-1和Aβ；免疫组化检测结肠紧密连接蛋白和炎症因子；qPCR检测结肠炎症因子mRNA，采用2^?ΔΔCt法。

研究结果显示：

3.1 APP/PS1小鼠中年龄依赖性肠道菌群改变：通过主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）发现，3月龄和6月龄WT与APP/PS1小鼠肠道菌群聚类在一起，提示年轻时基因型影响可忽略；9月龄成年小鼠形成与年轻对应组不同的聚类。门水平上，Bacteroidota在所有组中最丰富，其次为Firmicutes；9月龄时Bacteroidota和Campylobacterota相对丰度显著升高，Firmicutes、Proteobacterota和Deferribacterota显著降低。结论是肠道菌群随年龄演变，并在成年后期开始显著分岐。

3.2 老年APP/PS1小鼠全身炎症升高：采用ELISA检测3、6、9月龄WT和APP/PS1小鼠血清炎症因子。随衰老两种基因型均出现进行性全身炎症升高；9月龄APP/PS1小鼠较WT同窝小鼠呈显著促炎状态，血清白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α显著升高，IL-10虽无显著差异但有上升趋势。结论为老年APP/PS1小鼠出现外周促炎表型。

3.3 长期FMT对肠道菌群组成的影响：通过火山图、Venn图、Shannon和Simpson指数、LEfSe分析等比较菌群。3月龄至9月龄APP/PS1小鼠多个属丰度发生改变；9月龄APP/PS1组Shannon和Simpson指数相对3月龄有显著差异，但FMT组总体微生物多样性与9月龄APP/PS1组无差异。LEfSe分析显示，9月龄APP/PS1组Alistipes、Rikenella和Odoribacter丰度显著升高，Prevotellaceae_UCG-001丰度显著降低；长期FMT干预后这些改变被部分逆转。

3.4 FMT减轻肠道屏障功能障碍：通过免疫组化检测9月龄小鼠结肠紧密连接蛋白claudin、occludin和ZO-1。APP/PS1小鼠claudin-1和ZO-1染色强度较WT显著降低，提示肠屏障完整性受损；FMT后ZO-1和occludin水平显著增加，表明FMT可恢复紧密连接蛋白并修复肠道屏障。

3.5 FMT通过TLR4/NF-κB通路减轻APP/PS1小鼠肠道炎症：Western blotting显示APP/PS1小鼠结肠TLR4及其下游效应分子NF-κB显著上调；免疫组化显示结肠IL-1β、IL-6、TNF-α免疫反应性明显增加；qPCR显示结肠Il1b、Il6、Tnfa mRNA表达升高。6个月WT供体FMT有效逆转这些炎症改变，显著抑制TLR4和NF-κB表达，降低IL-1β、IL-6、TNF-α免疫反应面积及mRNA水平。结论为慢性肠道菌群失调促进APP/PS1小鼠TLR4/NF-κB信号通路激活和局部肠道炎症，长期FMT可改善该炎症状态。

3.6 健康菌群转移减轻APP/PS1小鼠AD病理：通过Congo-red染色和ELISA评估脑Aβ病理。APP/PS1小鼠Aβ斑块负担显著高于WT，脑匀浆Aβ₄₀和Aβ₄₂浓度显著升高；长期FMT干预显著降低APP/PS1-FMT组Aβ肽水平，表明来自健康WT供体的长期FMT可减轻脑淀粉样病理。

3.7 FMT减轻脑内小胶质细胞激活和炎症反应：通过免疫荧光检测离子钙接头蛋白1（ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba-1）评估小胶质细胞激活。9月龄APP/PS1小鼠脑内Iba-1阳性小胶质细胞明显增多，并主要聚集在淀粉样斑块周围；APP/PS1-FMT小鼠该激活明显减弱。皮层Western blotting显示APP/PS1小鼠TLR4和NF-κB蛋白水平高于WT，长期FMT显著下调。结论为FMT不仅减少淀粉样斑块负担，也减轻神经炎症；结肠和皮层中TLR4/NF-κB通路的协同调节进一步支持该通路介导微生物干预对AD病理的有益效应。

讨论部分总结：研究人员指出，肠道菌群是免疫反应的重要参与者，影响外周组织和CNS。本工作中APP/PS1小鼠随年龄出现肠道菌群分布改变，并伴肠道TLR4/NF-κB信号及下游细胞因子升高；从3月龄开始转移健康供体肠道菌群后，APP/PS1模型结肠TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低，皮层TLR4和NF-κB呈类似变化，提示TLR4是肠-脑通讯的潜在连接。FMT还减轻脑内Aβ沉积和小胶质细胞激活，产生CNS抗炎效应。APP/PS1模型可模拟认知功能障碍和老年斑沉积，通常约4–5月龄出现脑淀粉样聚集；本数据显示3月龄菌群分布基本不变，9月龄显著改变，提示年龄和AD病理均可改变肠道菌群。既往动物FMT持续时间通常未超过4周，最长16周，而AD发病是渐进过程，短期FMT对长期病理过程的影响尚不清楚；本研究的6个月长期FMT从病理前阶段开始，不仅恢复肠道菌群组成，也对AD病理产生持续保护，强调早期和长期微生物干预对AD预防的重要性。讨论还涉及Bacteroidota和Firmicutes为哺乳动物肠道最丰富门类，AD动物中Bacteroidota增加、Firmicutes减少；Bacteroidota比例与局部炎症状态相关，Firmicutes/Bacteroidota比值可能受Il1b、Il6、Il8、Tlr2、Tlr4和Tlr5表达影响。Bacteroidota可产生LPS等神经毒素，LPS作为革兰阴性菌外膜关键成分促进全身炎症。本研究生支持肠道菌群改变与全身促炎状态相关；APP/PS1小鼠claudin和ZO-1染色强度降低，提示肠屏障受损。菌群失调与肠屏障和BBB高通透性相关，可能促进LPS穿过肠壁到达脑，AD患者循环LPS浓度较健康个体高3–6倍，这或可解释APP/PS1小鼠外周和脑内炎症反应升高。Bacteroides属在AD患者中比例增加，AD相关动物模型中也富集，这些菌株可通过增强促炎信号和触发脑内小胶质细胞激活诱导AD样病理和认知损害；Bacteroides fragilis口服APP/PS1小鼠可增大Aβ斑块负荷、改变小胶质细胞转录谱并下调吞噬活性；甲硝唑清除Bacteroidota可减少老年5xFAD小鼠淀粉样沉积。因此，Bacteroidota丰度改变可能通过抑制小胶质细胞功能、损害Aβ清除和促进淀粉样沉积影响AD进展。外周全身炎症可诱导和加剧脑内免疫反应，炎症衰老促进AD进展；动脉粥样硬化、抑郁、糖尿病和肥胖等AD可调风险因素常共享慢性低度炎症。动脉粥样硬化中胆固醇沉积和氧化低密度脂蛋白形成与TLR4相互作用，增加NLRP3炎症小体组分，促进IL-1β和IL-18释放；热量限制可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路抗炎症衰老，提示TLR4在炎症衰老中有潜在作用。LEfSe分析发现Alistipes、Rikenella和Odoribacter是老年APP/PS1小鼠关键改变属，FMT部分逆转；这些属属于Bacteroidota，富集可能增加LPS暴露。研究人员认为肠道菌群来源LPS可能易位至脑并促进AD进展；LPS作为TLR4典型激动剂，主要通过TLR4/NF-κB通路触发炎症，年龄相关菌群改变可能通过LPS驱动的TLR4/NF-κB激活及后续神经炎症影响认知衰退。除LPS外，短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）也可能参与；Bacteroidota是乙酸和丙酸的主要产生者，Firmicutes主要产生丁酸。SCFAs可通过激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白去乙酰化酶调节神经炎症，减少促炎细胞因子并增强调节性T细胞分化；丁酸能够通过TLR4/NF-κB通路抑制小胶质细胞激活，提示其与LPS驱动机制可能汇聚。但本研究未定量分析SCFAs或其他微生物代谢物，无法确定组成变化是否改变SCFA产生，也无法得出SCFAs与TLR4/NF-κB信号直接相关的结论。益生菌可逆转衰老相关肠壁和BBB损伤，减少LPS进入循环，降低脑内TLR4和NF-κB；本工作显示FMT可部分逆转肠道菌群分布改变，并通过抑制脑内TLR4/NF-κB信号减轻AD病理改变。结肠和皮层TLR4、NF-κB表达变化一致；既往无菌小鼠定植老龄小鼠来源菌群后血清可激活TLR2和TLR4，提示老龄菌群转移可促进促炎细菌成分全身传播。临床相关性也见于其他疾病：帕金森病患者循环LPS水平升高，尸检黑质TLR4表达上调，且存在肠道炎症；炎症性抑郁患者肠道促炎Bacteroides丰度较高，肠黏膜TLR4水平升高。这些研究支持肠道TLR4信号激活可能是连接菌群失调与炎症衰老和神经炎症的共同下游机制。局限性包括：本研究FMT前未进行抗生素预处理，抗生素预处理常用于促进供体菌群定植但必要性仍有争议，既往报道其与FMT结局无显著关系；本研究采用长期间歇FMT，可能部分补偿未进行抗生素清除。第二，未检测循环血清LPS水平，无法建立肠屏障功能障碍、LPS易位与肠道和脑内TLR4/NF-κB信号触发之间的直接因果联系，而这是AD肠-脑轴的关键机制步骤。第三，虽然衰老改变肠道菌群分布，主要表现为门水平Bacteroidota比例升高和Firmicutes减少，但具体菌株仍不清楚；未来研究拟鉴定促进TLR4激活和AD发病的特定Bacteroidota成员，以进一步阐明疾病进展机制和治疗靶点。

结论翻译：总体而言，该工作提供支持性证据，表明衰老和AD进展驱动肠道菌群失调向促炎表型转变，导致TLR4/NF-κB通路激活。在显著菌群改变和淀粉样沉积之前开始，使用健康肠道菌群进行FMT可部分将肠道菌群恢复至年轻样谱。此外，FMT显著减少肠道炎症和神经炎症，减轻淀粉样沉积，并减少脑内小胶质细胞激活，这些与TLR4/NF-κB通路密切相关。研究结果提示，病理前阶段的FMT干预可能预防AD病理和炎症反应进展。这突出表明早期干预是基于菌群的AD预防策略成功的关键因素。未来研究应探索驱动促炎转变的特定细菌菌株，并进一步阐明这些菌株影响宿主免疫和炎症反应的分子机制。