基于CO1基因的肯塔基特有洞穴步甲Neaphaenops tellkampfii系统地理学：Barren River基因流屏障与N. meridionalis Barr, New Status的种级提升

《Ecology and Evolution》：Phylogeography and Population Genetics of the Kentucky Endemic Cave Beetle Genus Neaphaenops Jeannel (1920) (Coleoptera: Carabidae: Trechini)

　　

洞穴甲虫是研究洞穴栖息地内进化历史和物种形成的优良类群。然而，其在相关研究中代表性不足，尤其是在北美，该地区是洞穴生物多样性热点，甲虫占已记录分类单元的显著比例。本研究旨在阐明肯塔基中部特有洞穴甲虫 Neaphaenops tellkampfii (Erichson) 种群的进化历史、可能的连通性或基因流屏障，并检验四个建议亚种的有效性。研究人员从62个洞穴采集标本，提取DNA，并测序细胞色素C氧化酶亚基I（CO1）基因的1169 bp，获得内群36个系统发育信息位点。利用这些CO1数据，研究人员构建贝叶斯、最大似然和简约法系统发育树，并可视化遗传结构。所有分析均显示该甲虫存在两个截然不同的南部和北部超级种群，二者被Barren River分隔。基于分子证据，研究人员提出新概念：四个形态学定义的亚种应视为无效。三个北部亚种：N. t. tellkampfii (Erichson)、N. t. viator Barr和N. t. henroti Jeannel应被认定为单一物种N. tellkampfii (Erichson)，而南部亚种N. t. meridionalis Barr应提升至种级，作为N. meridionalis Barr, New Status。本研究还发现了26个新的Neaphaenops种群。每个支系内观察到高遗传相似性，可能表明密西西比高原内洞穴之间存在高度历史或近期互连，促进了地下扩散和基因流。总之，研究表明Neaphaenops或其他洞穴甲虫可作为研究洞穴系统内物种形成、基因流、进化历史和连通性的生物学模型。

洞穴环境完全缺乏光照，无光合初级生产力，温度恒定且湿度高，类似岛屿，常容纳多样化且潜在隔离的特化种群。洞穴物种被认为由地表祖先独立入侵洞穴栖息地后进化而来，主要有气候残遗假说和适应转移假说；与地表祖先进化基因流缺失、地下通道扩散能力有限和物理隔离被认为导致洞穴生物如甲虫的物种形成。洞穴生物分布通常受限、扩散能力低且多样性高，适合生物地理或系统地理学（phylogeography，整合遗传和地理数据以研究生物地理历史、扩散与隔离、隐存种多样性和物种形成模式）和物种形成研究，但其进化与物种形成机制难以探索，原因包括采样困难、形态趋同和地表祖先灭绝。近年来遗传技术进展提供了更多见解。北美东部trechine洞穴甲虫包含五属，Neaphaenops为单型属，N. tellkampfii有四个建议亚种；肯塔基中部喀斯特系统是全球最长洞穴系统Mammoth Cave所在地，是北美地下生物多样性和特有性热点。N. tellkampfii是Mammoth Cave最大、最丰富、分布最广的甲虫，常见于粉砂和砂质地点，称沙甲虫，与洞穴蟋蟀Hadenoecus subterraneus密切相关，主要食其卵和若虫。其宽分布被假设与主动觅食者的大体型和密西西比高原高度洞穴化喀斯特灰岩有关。既往研究涵盖生物学、食性、生态、形态、脑解剖、种群生态和适应，也用同工酶研究遗传变异和基因流，但样本小且同工酶数据可能误导。Philips et al. 曾用CO1和arginine kinase序列检验亚种，但受种群限制。研究人员开展本研究，以DNA序列评估Neaphaenops进化历史，检验亚种单系性，识别基因流屏障或连通性，并发现新种群；本研究得出Barren River两侧两个强支持支系，并修订分类。主要意义在于将Neaphaenops作为研究洞穴系统内物种形成、基因流、进化历史和连通性的生物学模型。

关键技术方法：研究人员于2012年6月起并在2023年至2024年12月期间在肯塔基中部62个洞穴采集N. tellkampfii，59个洞穴101个样本提供CO1数据；外群为GenBank下载的9种Pseudanophthalmus，最终比对110个分类单元、1169 bp CO1。DNA提取、PCR和Sanger测序后，用Geneious编辑比对；JModelTest选择GTR+I+G；MEGA构建最大似然（Maximum Likelihood, ML）树，MrBayes构建贝叶斯树，WinClada/NONA构建简约法（Parsimony）树；并以广义混合Yule溯祖（General Mixed Yule Coalescent, GMYC）、SplitsTree分裂网络、PopART最小跨度单倍型网络及p距离（p-distance）矩阵分析遗传结构和基因流屏障。

研究结果：
3.1 分子系统发育：所有系统发育分析揭示两个强支持支系，分别对应Barren River南部CL1（12个洞穴）和北部CL2（47个洞穴），并由CO1 1169 bp中的19 bp协同衍征支持。ML树中CL1 bootstrap为96、CL2为80；贝叶斯树中CL1后验概率为100、CL2为81；简约法严格一致树L=333、CI=70、RI=91，多数一致树L=298、CI=79、RI=94；GMYC支持两物种模型（似然比=52.99；p<0.001）。Pseudanopthalmus barbari为Neaphaenops姐妹群。
3.2 遗传结构：分裂网络独立确认CL1和CL2两个遗传 distinct 簇，具强bootstrap支持；最小跨度单倍型网络显示相同两个超级种群。101个个体中识别出31个独特单倍型，CL1与CL2间有19个固定核苷酸差异，各支系内固定差异≤4个，并可见一定地理结构。
3.3 遗传相似性与基因流屏障：Barren River是两超级种群间主要基因流屏障。CL1与CL2间CO1差异为1.7%–2.7%；CL1内相似性99.1%–100%，CL2内99.2%–100%；与Pseudanophthalmus外群相似性为89.8%–92.4%。最大p距离CL1为0.003、CL2为0.008、CL1–CL2为0.022。
3.4 历史和新的洞穴记录：62个采样洞穴中，各县洞穴数分别为Green 5、Warren 14、Hart 8、Edmonson 10、Barren 8、Hardin 4、Simpson 3、Allen 3、Meade 2、Breckinridge 2、Metcalfe 2、Grayson 1。新发现26个Neaphaenops种群，分布于Meade 1、Hardin 1、Grayson 1、Hart 3、Green 1、Edmonson 5、Warren 8、Barren 3、Allen 1和Simpson 2个洞穴。

讨论部分总结：所有分析一致支持Barren River南北两个支系。既往同工酶研究样本少、分辨率低；本研究CO1显示支系间差异达到或超过≥2%种间阈值。遗传分析强烈拒绝N. tellkampfii分为四个亚种；Barr基于形态定义的亚种及杂交/渐变未获分子证据支持。南部种群构成单系支系，北部三个亚种合并为N. tellkampfii，南部提升为N. meridionalis Barr, New Status。系统发育还显示Neaphaenops与P. barbari为姐妹，而Benito et al. 对东部北美trechine的研究提出N. tellkampfii与P. troglodytes约5 MYA分化，Barr提出的与P. pubescens和P. princeps近缘未获支持。关于基因流屏障，Barren River可能因低曲流频率、非喀斯特砂岩、石灰岩开口较少而成为屏障；Green River蛇曲较多，Neaphaenops跨河扩散常见，其他溪流未见阻碍。Ohio River为北界，西部煤盆地非洞穴岩、南部和东部St. Louis与Warsaw石灰岩接触及Hadenoecus缺失限制分布。历史和新记录方面，本研究探索Barr列出的36个洞穴并新增26个采样洞穴，12县中10县发现新种群；部分历史洞穴未再发现种群，入口关闭或未进入。

研究结论翻译：这项基于近1200 bp CO1基因的系统地理学研究表明，Neaphaenops存在显著系统发育分裂，两个不同支系对应两个超级种群，分别位于Barren River南北。研究人员提出新概念：这些支系应被视为两个独立物种，北部为N. tellkampfii (Erichson)，南部为N. meridionalis Barr, New Status。Green River南北洞穴内的高遗传相似性可能表明强互连（至少直到相对近期），使密西西比高原大喀斯特内各区域发生基因流。从未报道洞穴发现新种群进一步扩展已知分布，或许突出继续探索未采样洞穴和保护努力的需要。由于这两个Neaphaenops种分布广，二者可被认为灭绝风险低，尽管洞穴系统通常对干扰相当脆弱。未来研究应检验自然干扰如洪水，以及人为影响如洞穴参观或污染，如何影响该种和其他troglobionts（真洞穴生物）的行为和扩散。最后，该种是评估其范围内洞穴连通性的有效模型，并且可能反映该区域许多其他洞穴生物的基因流模式。