《Ecology and Evolution》：COI Barcoding Unveils Hidden Fish Diversity and Potential Cryptic Lineages in Inner Mongolia, China
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内蒙古高原淡水鱼类区系在分子水平上的特征化程度仍然较低，尽管其具有独特的地理生物学背景，即黄河（Huang He）水系与多个孤立的内流盆地相结合。为弥补这一知识空白，研究人员于2021年至2025年间在内蒙古主要河流系统的99个采样点开展了系统性采样，生成了9
内蒙古高原淡水鱼类区系在分子水平上的特征化程度仍然较低，尽管其具有独特的地理生物学背景，即黄河（Huang He）水系与多个孤立的内流盆地相结合。为弥补这一知识空白，研究人员于2021年至2025年间在内蒙古主要河流系统的99个采样点开展了系统性采样，生成了984条细胞色素c氧化酶亚基1基因（COI）条形码序列，并与96条公开序列合并，构建了包含1080条序列的数据集。结合形态学鉴定与两种基于树种的物种界定方法（mPTP和GMYC），研究人员恢复了70个分子操作分类单元（OTUs），对应62个形态学鉴定物种和3个未鉴定谱系。检测到的物种仅占该地区历史记录物种的54.39%，而多个广布种（如Abbottina rivularis、Barbatula toni和Rhinogobius cliffordpopei）表现出显著的遗传分化，并被划分为多个独立的OTUs，揭示了被忽视的隐存多样性。本研究证明了COI条形码在区域鱼类多样性快速评估和隐存物种发现方面的有效性，同时也凸显了单基因座标记在解析近期分化谱系方面的局限性。本文所建立的条形码参考数据集和所识别的隐存谱系，为该生态脆弱区域的水生生物多样性保护、渔业管理和环境影响评估提供了关键的基础数据。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
内蒙古高原位于中国北方干旱半干旱地区，其水系网络兼具外流区与内流区双重特征：外流区由黄河支流构成，内流区则包括多个汇入呼伦湖、乌梁素海、岱海和达里诺尔湖的孤立水系。这些内流水系在 hydrological 上相互隔离，多处于蒸发强烈的海拔较高环境，孕育了独特且特有性较高的鱼类区系，是研究适应性进化和生物地理学的理想体系。然而，这些生态系统极为脆弱，近年来因气候变化加剧和人类活动增强——主要表现为农业灌溉导致的河流断流、工矿活动造成的水体重金属污染，以及过度放牧和草地开垦引起的水土流失——水生生物多样性面临严重威胁。
关于内蒙古鱼类多样性的最详尽记录来自《内蒙古动物志》，共记载114种鱼类，主要基于传统形态学分类。然而，传统形态学鉴定在区分表型可塑性强的近缘种、识别不同生活史阶段的个体以及发现形态上难以区分的隐存种方面存在固有局限。此外，过去几十年间内蒙古的水文格局和环境质量发生了深刻变化，基于当代样本的系统评估仍然缺乏，难以判断历史记录物种是否持续存在、其分布是否发生迁移，以及仅凭形态学手段可能遗漏多少多样性。尽管COI条形码技术已在长江和黄河干流等大型河流系统的鱼类多样性研究中得到广泛应用，但其在内蒙古这一独特地理单元——无论是黄河上游还是内陆闭流水系——的应用仍十分有限，且多集中于特定湖泊系统。区域尺度的鱼类分子多样性评估尚属空白。
二、研究设计与技术方法
研究人员于2021至2025年间在内蒙古主要河流系统的99个采样点共采集984尾鱼类样本，依据《内蒙古动物志》进行形态学鉴定，未匹配文献描述且无法鉴定的标本归为未鉴定类群。组织样本以95%乙醇保存，部分凭证标本以10%甲醛固定。所有动物实验方案经河南师范大学生物研究伦理委员会批准，符合《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892–2018）。分类鉴定依据Eschmeyer鱼类目录进行核验与更新。
关键技术方法主要包括：第一，DNA提取采用高盐提取法，选取线粒体COI基因作为分子标记，使用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经双向测序后拼接为一致序列，比对并修剪至统一长度486 bp。第二，以新获得序列为查询序列，通过BLAST搜索从NCBI核苷酸数据库获取96条相关COI序列，每条查询序列选取相似度最高的3–4条且分类归属明确的序列。第三，遗传距离分析基于Kimura 2-parameter（K2P）模型，利用MEGA 11计算成对遗传距离，并通过R软件自定义脚本计算最大种内遗传距离（MaxIntra）和最小种间遗传距离（MinInter），绘制散点图和密度曲线以评估条形码间隙的存在。第四，物种界定采用两种基于树的方法：多速率泊松树过程（mPTP）和一般混合Yule-coalescent模型（GMYC），最终以50%共识方案确定分子操作分类单元（OTUs）。系统发育树构建使用RAxML最大似然法和BEAST软件包生成超度量树。
三、研究结果
3.1 条形码数据库的建立与物种组成
研究人员建立了包含1080条序列的COI条形码数据库，涵盖10目19科45属62种。其中鲤形目（Cypriniformes）占45种，虾虎鱼目（Gobiiformes）4种，攀鲈目（Anabantiformes）、颌针鱼目（Beloniformes）、鲈形目（Perciformes）、鲑形目（Salmoniformes）和鲇形目（Siluriformes）各2种，鳉形目（Cyprinodontiformes）、鳕形目（Gadiformes）和胡瓜鱼目（Osmeriformes）各1种。此外还恢复了3个未鉴定谱系，其中1个可能代表未描述物种。将相同序列经ALTER折叠为单倍型后，共鉴定254个独特单倍型。
3.2 与历史记录的差异
依据Eschmeyer目录对《内蒙古动物志》记载的淡水鱼类进行分类学信息校正后，共获得114种历史记录物种。本研究鉴定到的物种数占历史记录的54.39%，这一显著差异可能源于两方面原因：一是部分历史记录物种因水文改变和栖息地退化而局部灭绝，或仅分布于本次调查未覆盖的区域；二是传统形态学方法在区分近缘种和识别隐存种方面存在固有局限。
3.3 遗传距离分析
最大种内遗传距离为0.276（鲫Carassius auratus），最大最近邻距离为0.237（圆尾斗鱼Macropodus ocellatus）。平均最大种内距离为0.077，平均最近邻距离为0.075，后者平均为前者的9.36倍。28个形态学鉴定物种的最小种间距离低于1%，其中15个物种与最近邻物种距离为零。28个物种的最大种内距离超过2%，部分高达27.5%。27个物种的最大种内遗传距离大于其最小种间遗传距离。种内与种间遗传距离密度分布曲线呈现显著重叠，表明即使采用共识OTU方案，仍不存在清晰的条形码间隙，反映了单基因座COI条形码在解析近期分化或杂交谱系方面的固有局限。
3.4 物种界定结果
mPTP生成68个OTUs，GMYC生成80个OTUs，共识方案产生70个分子OTUs。62个形态学物种中有56个与共识OTUs一一对应，一致率为80%。4个形态学物种被细分为多个共识OTUs：Abbottina rivularis分为3个OTUs（OTU22、OTU23、OTU24），Barbatula toni分为3个OTUs（OTU36、OTU37、OTU38），Rhinogobius cliffordpopei分为2个OTUs（OTU66、OTU67），Gnathopogon strigatus分为2个OTUs（OTU15、OTU16）。3个未鉴定谱系形成独立OTUs（OTU14、OTU28、OTU70），其中OTU14采集自黄河水系乌梁素海区域，与Gnathopogon属序列相似度最高（93%）；OTU28和OTU70分别采集自黄河支流大黑河流域和克鲁伦河流域，与鳅科（Cobitidae）和鱊亚科（Acheilognathidae）序列最为近缘。
四、讨论与结论
本研究发现多个广布种内部存在显著的遗传分化，包括Carassius auratus（27.5%）、Hemibarbus maculatus（26.8%）、Saurogobio dabryi（25.9%）、Channa argus（24.1%）和Misgurnus mizolepis（22.8%）等，这些数值虽在标准DNA条形码调查中异常，但与此前系统地理学研究一致。例如，Carassius auratus复合种包含多个深分化的线粒体DNA谱系，Abbottina rivularis包含4个主要线粒体谱系。这些模式反映了内蒙古高原独特水系格局——黄河外流系统与多个孤立内流盆地——对淡水鱼类种群分化的深刻塑造作用。
物种界定方法的比较显示，GMYC倾向于过度拆分，而mPTP可能对谱系间异质进化速率更为稳健。遗传距离分析揭示的条形码间隙缺失，即使在OTU基础上重新计算后也未完全消除，凸显了单基因座COI条形码在包含近期分化谱系的区域研究中的固有局限。对于Triplophysa属和?亚科（Gobioninae）等复杂类群，未来需整合核基因标记或线粒体基因组数据以阐明其进化关系。
本研究对内蒙古鱼类保护具有多重意义：三个遗传上独特的未鉴定谱系及广布种内的隐存谱系代表独特的进化遗产，应优先作为进化显著单元（ESUs）加以保护；许多珍稀物种和隐存谱系可能高度依赖特定栖息地，气候变化驱动的河流断流和人类活动可能使这些未描述谱系在分类地位完全明确之前面临更高的灭绝风险；鉴于历史记录与当前调查之间的差异，基于更新的整合形态学和分子学数据重新评估内蒙古鱼类的保护状况，并建立动态监测框架十分必要。本研究未覆盖阿拉善盟这一属于河西走廊—阿拉善独立内流水系的区域，历史上该区域栖息有Hedinichthys macropterus和Triplophysa jiuzhaiensis等特有鱼类，采样空白不可避免地限制了研究结果对整个内蒙古的代表性。
研究结论翻译如下：本研究对内蒙古主要河流系统进行了系统采样，获得984尾鱼类的COI条形码序列，结合公共数据库序列构建了包含1080条序列的分析数据集。基于形态学鉴定与两种分子物种界定方法（mPTP和GMYC）的整合分析，研究人员划定了70个分子操作分类单元（OTUs），对应62个形态学鉴定物种，并恢复了3个遗传上独特的未鉴定谱系。本研究恢复的物种约占《内蒙古动物志》历史记录的54.39%，但这一比较应谨慎解读。研究结果凸显了未来扩大采样覆盖范围、纳入环境DNA（eDNA）等互补方法的必要性。同时，本研究发现隐存多样性——包括多个广布物种的种内分化和3个推定新种——表明传统分类学可能低估了内蒙古实际鱼类多样性，分子方法的整合为理解该区域鱼类进化历史提供了新视角。本研究验证了COI条形码在鱼类多样性快速评估和隐存物种识别方面的有效性，同时强调了单基因座标记在界定近期分化谱系方面的局限性。总体而言，本文建立的COI条形码数据集和所识别的隐存谱系，为内蒙古水生生物多样性保护、渔业管理和环境影响评估提供了关键基础数据和科学依据。
