基于3RAD-SNP的线纹蛇（Tropidoclonion lineatum）全分布区种群结构基因组评估：亚种有效性存疑与边缘种群保护启示

《Ecology and Evolution》：Genomic Investigation of Population Structure in a Secretive, Semi-Fossorial Snake (Colubridae: Tropidoclonion lineatum) Across the Great Plains

　　

随着基因组技术的进步，生成大量位点以解决种群遗传学（population genetics）和系统地理学（phylogeography）问题已日益可行。然而，许多广布且相对丰富的物种仍缺乏分子方法取样。线纹蛇（lined snake，Tropidoclonion lineatum）是一种分布于大平原的半穴居（semi-fossorial）蛇，即为此类例子之一。尽管历史上基于形态特征变异曾承认多个亚种，但由于缺乏凭证遗传样本，迄今尚未开展正式的种群结构分子研究。在此，研究人员利用三酶限制性位点相关DNA（triple-enzyme restriction site-associated DNA，3RAD）测序产生的全基因组单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs），首次对T. lineatum全分布区种群结构进行基因组评估。结果指示大平原范围内基因流大体连续，对已承认亚种的有效性提出质疑。相比之下，南达科他州北部分布区边缘种群表现出相对遗传同质性，并与更南部种群存在中等分化，可能反映近期隔离或边缘栖息地中遗传漂变增强。鉴于该物种在南达科他州的濒危状况，这些发现突显范围边缘种群的保护重要性，同时强调需要更密集的全分布区采样——尤其是在推测不连续区域——以充分表征T. lineatum的遗传多样性。

研究背景与问题。穴居生活史策略（fossoriality）指地下掘穴，在鳞龙类（蜥蜴和蛇）中多次演化，并被认为是蛇的祖先状态。穴居蛇专化程度不一，从盲蛇类（scolecophidians）到缺乏明显形态改造的类群。隐秘性使检测困难，阻碍自然史、种群丰度和演化研究，导致调查数据和博物馆收藏偏差；许多常见广布穴居蛇缺乏种群和系统地理结构评估，尽管证据表明穴居鳞龙类可能隐藏未识别隐存多样性。线纹蛇（Tropidoclonion lineatum）是单型属小型半穴居蛇，分布于美国大平原大部分地区。其大部分时间在地下，善在松湿土壤掘穴，取食蚯蚓和其他小型无脊椎动物。该种主要出现于草地、开阔林和泛滥平原，海拔低于1500 m，但也有高于2000 m记录，包括新墨西哥Torrance County约2810 m。其分布从得克萨斯中南部到明尼苏达西南和南达科他的北部界限；在南达科他和明尼苏达分别为州濒危和特别关注。尽管分布广，博物馆组织样本少，例如科罗拉多种群无公共机构组织样本；该种仅纳入少数高级分子系统发育分析。因此，种内结构和种群水平遗传变异了解不足。历史上基于尾部和腹鳞计数微小差异描述五个亚种：T. l. lineatum、T. l. iowae、T. l. mertensi、T. l. texanum、T. l. annectens。T. l. iowae因缺乏诊断特征差异被同义为T. l. lineatum。其余亚种未广泛承认，因为Ramsey（1953）和Smith and Smith（1963）提出的范围广泛重叠，并存在宽阔杂交区。许多大平原两栖爬行动物显示显著种群分化和遗传结构，因此T. lineatum可能也有类似模式，亚种分类有效性需现代分子方法检验。另外，边缘种群可能因差异选择制度减少来自核心种群的有效基因流并促进局地适应而显著分化。南达科他James River近期发现看似不连续种群，仅约4000 ha，与Big Sioux River种群隔离；James River南部Yankton County和东部Vermillion River未发现，结合小穴居蛇扩散能力有限，可能为隔离、潜在独特谱系。研究目的：用全基因组SNP初步评估全分布区种群结构，估计James River种群有效种群大小，评估其与核心种群基因流。

研究人员获得36份T. lineatum组织样本，代表12个分布州中的7个。采用3RAD测序产生全基因组SNP。结果回收132,499 loci和684,738 SNPs；4份样本未满足质量要求被移除。最终用于STRUCTURE和PCA的23,264 SNPs中8,483个非连锁SNPs用于种群结构。STRUCTURE根据Evanno ΔK方法支持K=2，显示沿纬度渐变的弱种群结构；北部个体主要属于遗传组1，南部更多属于组2；等位基因频率逐渐变化，提示弱遗传分化而非明确边界。PC1解释11.6%总变异，北部样本负值，南部逐渐正值。系统发育网络支持纬度遗传渐变，多数样本按地理邻近聚类，内布拉斯加样本位于南达科他和堪萨斯之间。TNHC 111755（Hutchinson County, SD）因80.67%缺失数据，聚类异常，可能为假象。最大似然（maximum likelihood，ML）树中T. l. lineatum形成高支持簇（排除TNHC 111755），但在多物种合并（multispecies coalescent，MSC）树中不支持，且在任何rooting下与单系不兼容；T. l. annectens在MSC中高支持，但ML未恢复；T. l. mertensi在三种方法中一致为独特高支持簇。James River种群在所有拓扑中高支持聚为独特簇。隔离距离（isolation by distance，IBD）检验显示成对遗传距离与地理距离强正相关（R=0.863，p=0.001）。James River种群有效种群大小（effective population size，N_e）在85%双等位数据集未考虑连锁不平衡时为163.7，参数置信区间162.8–164.6；jackknife置信区间22至无穷。每locus单SNP数据集估计N_e为426.5（参数置信区间368.1–506.6，jackknife置信区间61至无穷）。因高不确定性和仅15个体，需谨慎解释。James River和核心种群观测杂合度（observed heterozygosity，H_o）很相似，James River略低（0.077；单SNP为0.100，核心为0.087；单SNP为0.116）。James River与其他样本遗传分化指数（F_ST）为0.097（单SNP为0.103），指示近期种群隔离的中等分化。该研究首次对Tropidoclonion进行种群基因组结构评估，质疑已承认亚种，并强调边缘种群保护重要性。

为开展研究，研究人员使用36份T. lineatum组织样本（肝、尾夹、血），覆盖美国12个分布州中的7个州：南达科他、明尼苏达、内布拉斯加、堪萨斯、俄克拉何马、新墨西哥、得克萨斯；标本来自TNHC、FHSM、OMNH、OCGR、MSB等博物馆；未能获得爱荷华、伊利诺伊、密苏里、阿肯色、科罗拉多样本。关键技术包括：三酶限制性位点相关DNA（3RAD）测序与iPyrad组装loci和SNP；STRUCTURE和PCA进行聚类；SplitsTree网络、RAxML最大似然、Tetrad/SVDquartets多物种合并树进行系统发育推断；Mantel检验评估IBD；NeEstimator连锁不平衡法估计N_e；HIERFSTAT和scikit-allel计算H_o与F_ST。

结果部分未设二级小标题，原文依次报告如下。种群聚类与PCA：通过8483个SNP的STRUCTURE和PCA分析，发现K=2，北部与南部遗传组沿纬度渐变，PC1解释11.6%变异。系统发育网络、ML和MSC：网络显示地理邻近样本聚类，内布拉斯加样本位于南北类群之间；ML中T. l. lineatum高支持，MSC中T. l. annectens高支持，而T. l. mertensi在三种方法中一致高支持；James River种群在所有拓扑中高支持聚为独特簇。隔离距离：Mantel检验显示遗传距离与地理距离强正相关（R=0.863，p=0.001）。James River有效种群大小与杂合度：85%双等位数据集估计N_e为163.7，单SNP每locus数据集为426.5，但jackknife置信区间宽；James River与核心种群H_o相似，James River略低；James River与其他样本F_ST为0.097，提示近期隔离的中等分化。

讨论部分总结。综合结果指示T. lineatum种群遗传结构更宜描述为渐变而非多个离散单元。尽管南部采样稀疏，分布连续性、线性IBD和缺乏遗传结构支持弱分化和大量连通。类似模式在北美大平原其他广布两栖爬行动物中也有发现，可能反映大平原相对连续景观、缺乏显著地形屏障，促进大尺度扩散和基因流。亚种定义争议多，但Ramsey（1953）和Smith（1965）描述的亚种似乎遵循用表型性状变异作为演化分化和地理结构代理的历史先例；这些性状常渐变、非离散或部分重叠。20世纪50—60年代亚种描述高峰，现代方法缺乏，因此亚种划分主要基于有限形态字符，可能反映误读的种内变异。系统发育分析质疑至少T. l. lineatum和T. l. annectens的有效性；支持取决于推断方法。拓扑不一致可能来自模型假设违反、演化过程和基因流；ML忽略不完全谱系分选（incomplete lineage sorting，ILS），MSC明确建模ILS；基因流也可导致弱支持和不一致，网络支持T. l. annectens与T. l. lineatum间连通。T. l. mertensi在所有方法中一致为高支持簇，但西部堪萨斯、俄克拉何马和得克萨斯采样缺口限制分类推断；T. l. texanum仅单样本。需要增加全分布区采样，尤其欠采样区域，并纳入合适外群（如Regina grahamii或其他Thamnophiini）用于rooting。鉴于分子证据削弱四个亚种作为独立地理结构种群的解释，应重新检查用于划界的形态字符。Ramsey识别三个亚种和Smith后续描述T. l. mertensi主要基于腹鳞和尾鳞差异，均存在重叠；T. l. annectens腹鳞较高，T. l. mertensi较低；T. l. texanum雄性尾鳞显著较低。但Ramsey注意到26个标本为T. l. annectens与T. l. lineatum中间型，37个为T. l. annectens与T. l. texanum中间型，且多个字符呈南北地理梯度。中间型和连续基因流分子信号提示这些字符可能为渐变而非离散。建议未来研究重新检查四个亚种分类有效性。James River种群可能近期地理隔离；采样有限，无法全面比较遗传多样性，但H_o与核心种群相当但略低。边缘分化种群通常预期遗传多样性降低，这一结果有些意外；中等低F_ST和相当H_o的可能解释是colonization后近期隔离，边缘环境波动增强遗传漂变和分化。该假设有待其他小型穴居蛇测试，James River种群是有前景系统。保护方面，边缘种群保护重要性日益被认识，James River种群可能是保护优先；潜在近期隔离、推测小N_e、南达科他州濒危。建议继续栖息地保护和长期监测。两个看似不连续种群（丹佛，科罗拉多；圣路易斯，密苏里并延伸至伊利诺伊）未采样；需要密集全分布区采样，尤其这些残遗种群，以充分表征遗传多样性和种群结构并指导保护管理。

研究结论部分翻译：日益认识到范围边缘种群保护努力的重要性，James River种群可能代表这样一个保护优先对象。其潜在近期隔离、推测较小的有效种群大小以及南达科他州濒危状态，凸显其保护意义。研究人员建议继续保护努力，聚焦栖息地保护和James River种群长期监测。此外，两个看似不连续的种群，一个在科罗拉多州丹佛地区，另一个以密苏里州圣路易斯为中心并延伸至伊利诺伊州，未包含在数据集中。密集的全分布区采样，特别是纳入这些残遗种群，将是充分表征T. lineatum遗传多样性和种群结构，并为未来保护管理决策提供信息所必需的。