真菌β-1,3-葡聚糖酶的比较表征、固定化及流化床反应器连续白葡萄酒澄清研究

《Food Frontiers》：Fungal β-1,3-Glucanases: Characterization and Immobilization for Continuous Application in Winemaking

　　

该工作提出了一种基于固定化β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）用于白葡萄酒澄清的创新连续生物催化系统。首先，对来自真菌来源Trichoderma harzianum和Aspergillus niger的两种β-葡聚糖酶（β-glucanase）进行最适温度和pH的比较表征。两种酶的最高催化活性均在50°C和pH 6.0。随后，由于Trichoderma来源β-葡聚糖酶在低温和酸性pH下具有较高催化效率和底物亲和力，研究人员选择其进行共价固定化（covalent immobilization）。固定化酶对温度和pH变化表现出增强的耐受性，并在重复使用循环中保持操作稳定性。随后，研究人员将固定化生物催化剂应用于流化床反应器（FBR，fluidized-bed reactor）处理模型白葡萄酒，在使用5 g固定化生物催化剂时，最大产物释放速率在流速560 mL/min（对应τ为0.54 min和S_v为1.87 min^?1）下实现。在这些最优条件下，于FBR中连续处理真实白葡萄酒导致β-葡聚糖有效降解，在24–48 h内降低约75%–80%。因此，研究人员证明在FBR中使用固定化食品级Trichoderma来源β-葡聚糖酶是连续酶法澄清葡萄酒的一种非常有前景的方法。

研究背景：白葡萄酒澄清和过滤是酿酒关键步骤，影响葡萄酒稳定性、外观和酒窖操作效率。葡萄汁和葡萄酒中天然存在的大分子，尤其β-葡聚糖，会增加黏度并显著影响过滤性能。β-葡聚糖多通过Botrytis cinerea（灰霉病菌）感染的葡萄进入酿造过程，该真菌在感染时产生大量β-1,3和β-1,6葡聚糖，积累于葡萄汁并可贯穿酿造。此类聚合物形成高黏度溶液，标准澄清方法难以去除，尤其对受Botrytis感染的葡萄酿造的葡萄酒更为明显。少量β-葡聚糖也可能来自发酵期酵母细胞壁或酒泥陈酿时酵母自溶。高浓度β-葡聚糖会降低过滤速率，使澄清困难。酶处理在现代酿酒中广泛应用，β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6）可水解β-葡聚糖链、切割糖苷键，降低分子大小和黏度，提高澄清和过滤性能，并可在酒泥陈酿中降解酵母细胞壁，释放甘露糖蛋白以改善口感和稳定性。但游离酶存在限制：葡萄酒低pH、乙醇、亚硫酸盐和酚类化合物可降低酶稳定性和催化活性，且可溶性酶难以回收复用，增加工业费用。固定化酶更稳定、可重复使用，适用于连续或大规模应用。流化床反应器（FBR）具有高效传质、低压降和易回收催化剂等优势，适合连续食品生物过程。该研究新颖性在于开发并表征固定化β-1,3-葡聚糖酶生物催化剂，并展示其连续处理葡萄酒的可行性。研究人员比较了T. harzianum和A. niger来源β-1,3-葡聚糖酶，选择T. harzianum来源酶进行共价固定化，采用食品级交联方法连接壳聚糖珠，并在FBR中评估催化性能和操作稳定性。结果表明，固定化T. harzianum来源β-葡聚糖酶在FBR中可有效降解真实白葡萄酒中的β-葡聚糖，显示连续酶法澄清葡萄酒的应用前景。

关键技术方法概括：研究人员以Trichoderma harzianum和Aspergillus niger来源β-1,3-葡聚糖酶为对象，采用SDS-PAGE分析蛋白条带，Bradford法测定蛋白含量，以P-NPC为底物测定酶活和Michaelis–Menten动力学，评估pH与温度曲线。将T. harzianum酶经壳聚糖珠和DAS交联剂共价固定化，优化初始蛋白浓度，并测定固定化酶动力学、储存稳定性和FBR操作稳定性。FBR中以模型白葡萄酒优化流速、停留时间与空速，再处理真实白葡萄酒；真实白葡萄酒由Donato Giangirolami Vineyards and organic wine（Latina, Italy）提供，用商品化酶比色试剂盒定量β-葡聚糖。

3.1 不同真菌来源游离β-1,3-葡聚糖酶的表征
3.1.1 电泳指纹：SDS-PAGE显示T. harzianum提取物在约66 kDa和32 kDa处有两条明显条带，符合两个β-1,3-葡聚糖酶同工型；A. niger提取物主要条带约56 kDa和39 kDa。还原和非还原条件下条带均可见，提示二硫键依赖的多聚化有限。T. harzianum条带更清晰、强度更高，提示其β-葡聚糖酶表达水平较高。
3.1.2 最适温度和pH：两种酶最适温度均为50°C，最适pH均为6.0。T. harzianum在80°C保留34%活性，在pH 4.0和pH 3.2分别保留28.8%和19.8%；A. niger在80°C保留48.8%，在pH 3.2和pH 2.6仅保留4.9%和1.3%。结果表明，T. harzianum来源酶在低温和酸性条件下仍保留可测活性，更适合酿酒酸性环境。
3.1.3 酿酒条件下的动力学表征：在pH 3.2、20°C和50°C下测定动力学。20°C时，T. harzianum的V_max为0.0082 IU/mgBSAeq，K_M为0.096 mM，k_cat为308.7 min^?1，K_a为3215.7 min^?1/mM；A. niger的V_max为0.066 IU/mgBSAeq，K_M为0.24 mM，k_cat为490.3 min^?1，K_a为2042.9 min^?1/mM。50°C时，T. harzianum的V_max为0.0100 IU/mgBSAeq，K_M为0.055 mM，k_cat为376.5 min^?1，K_a为6844.9 min^?1/mM；A. niger的V_max为0.269 IU/mgBSAeq，K_M为0.27 mM，k_cat为1998.3 min^?1，K_a为7401.1 min^?1/mM。R²均高于0.95。结论为A. niger转化率较高，但T. harzianum底物亲和力和低底物浓度下的催化效率更优，更适合酿酒条件，因此被选作固定化对象。

3.2 固定化β-1,3-葡聚糖酶的表征
3.2.1 固定化条件优化：初始蛋白浓度在0.10–1.00 mgBSAeq/mL范围内变化。固定化蛋白量随蛋白浓度增加，在1.0 mgBSAeq/mL时最高约2.1 mgBSAeq/g carrier，超过后下降。固定化酶比活力则随蛋白浓度增加而下降，在0.20 mgBSAeq/mL时最高约0.011 IU/mgBSAeq，代表固定化效率和酶功能保留的最佳平衡。浓度≥0.40 mg/mL时，扩散限制和位阻可能降低催化性能。因此选择0.20 mgBSAeq/mL为最佳固定化条件。
3.2.2 最适温度和pH：固定化酶最适温度仍为50°C，与游离酶相同；10°C时保留12%活性，热活性曲线更宽，显示热稳健性提高。固定化酶最适pH仍为6，与游离酶相同；pH活性曲线更宽，对pH变化敏感性降低，在pH 2.6–8.0范围内具有更好耐受性，有利于酿酒过程。
3.2.3 动力学表征：固定化T. harzianum酶在pH 3.2、10°C、20°C和50°C下测定。10°C时V_max为6.92×10^?5 IU/mgBSAeq，K_M为0.107 mM，k_cat为0.058 min^?1，K_a为0.054 min^?1/mM；20°C时V_max为0.00029 IU/mgBSAeq，K_M为0.038 mM，k_cat为0.024 min^?1，K_a为0.64 min^?1/mM；50°C时V_max为0.00047 IU/mgBSAeq，K_M为0.0054 mM，k_cat为0.039 min^?1，K_a为7.33 min^?1/mM，R²为0.98–0.99。固定化后主要动力学参数低于游离酶，但温度升高时K_M下降、催化效率升高。尽管催化性能降低，固定化酶具有操作稳定性、可重复使用、易分离、热和pH稳定性提高等优势，支持其在工业生物技术中的应用，并可集成至固定床或膜系统。
3.2.4 储存稳定性：固定化酶在4°C、pH 5.6乙酸缓冲液中储存35天。前7天保持全活性，14天降至约60%，21天低于40%，35天保留约20%初始活性，半衰期约14–17天。游离酶下降更快，4天降至约60%，8天约20%，储存期末仅10%–12%残留活性。固定化系统具有适合短期或批次生物技术过程的合理货架期。

3.3 流化床反应器连续应用：参数优化
在20°C下，用添加合成底物（1.0 mM）的模型葡萄酒优化FBR流速（Q_v，112–1064 mL/min）。R_p与Q_v呈钟形关系，从112升至560 mL/min时逐渐增加，在560 mL/min达到最大，之后在728和1064 mL/min下降。最大R_p为0.0195 μM/min mgBSAeq，对应Q_v为560 mL/min、τ为0.54 min、S_v为1.87 min^?1。更高流速缩短接触时间，反应可能不完全；低流速则可能因生物催化剂颗粒聚集而限制传质。因此560 mL/min为最佳操作条件。
3.3.1 操作稳定性：在560 mL/min、20°C、5.0 g固定化生物催化剂条件下进行20次连续反应循环。第一次复用保留约95%初始活性，3次后约80%，7次后约60%，10次后约45%，20次后仍保留约25%–30%。活性逐渐下降可能归因于反复操作中的酶失活以及底物或产物污染固定化载体。但20次循环后仍保留可观活性，显示其在酿酒中重复应用的潜力。

3.4 流化床反应器中白葡萄酒连续澄清处理
真实白葡萄酒中比较游离酶批式处理（1、3、6 g/hL，20°C）与固定化酶FBR处理（10°C和20°C）。总体而言，所有处理随时间增加均提高葡聚糖降解。游离酶呈剂量依赖：1 g/hL效果最低，3 g/hL显著增加，6 g/hL在游离酶中最高，48 h约降解72%–78%。固定化酶在20°C FBR中从2–4 h即显著高于所有游离酶剂量，4–8 h达到约70%–75%降解，24和48 h约75%–80%。固定化酶在10°C也表现渐进降解，在8–48 h接近最高游离酶浓度和20°C固定化系统。时间点比较显示，2 h时20°C固定化酶约30%降解，游离6 g/hL约20%，1、3 g/hL和10°C固定化酶活性很低；4 h时20°C固定化酶约60%，游离6 g/hL约30%；6–8 h时20°C固定化酶约70%–75%，游离6 g/hL约50%–60%，10°C固定化酶约30%–42%；24 h时各处理分别约为75%–80%、67%–70%、63%–66%、50%–55%、35%–40%；48 h时游离6 g/hL约72%–78%，20°C固定化酶约75%–80%，10°C固定化酶约68%–70%，3 g/hL约55%–60%，1 g/hL约48%–50%。结论为游离酶效率高度依赖剂量，而固定化酶在FBR中提供增强且持续的葡聚糖降解，尤其在中温条件下，证明FBR系统适合在真实葡萄酒条件下有效降低葡聚糖，支持其用于连续酿酒过程。

讨论部分总结：固定化酶动力学参数显著低于游离酶，但在操作稳定性、重复使用、分离便利性、热和pH稳定性方面具有优势，整体过程稳健性和经济可持续性更好。FBR中流速优化显示中间流速可获得最大催化效率。真实葡萄酒验证表明，固定化酶在20°C下快速且持续降解β-葡聚糖，在10°C下也保持活性并优于低剂量游离酶。研究结论翻译：研究人员对来自Trichoderma harzianum和Aspergillus niger的β-1,3-葡聚糖酶进行了比较生化和动力学分析，以鉴定适合以固定化形式应用于酿酒过程的候选酶。来自T. harzianum的酶因在酿酒条件下具有更优底物亲和力和催化有效性而被选用于固定化。共价固定化的Trichoderma来源β-葡聚糖酶应用于流化床反应器，为连续白葡萄酒澄清提供了高效、稳定且可放大的方法，显示其在酿酒学中的应用前景。在20°C下，FBR处理在4–8 h内实现约70%–75%的β-葡聚糖降解，优于同一时间范围内所有游离酶剂量，并在24和48 h维持约75%–80%的高降解率。即使在10°C下，固定化酶也表现渐进性葡聚糖降解，其活性接近20°C固定化系统。未来工作将聚焦于过程放大和中试验证，以评估所提出生物催化系统的工业适用性；在此背景下，将进行全面的技术经济分析并与现有工业过程比较，以评估生产成本、操作可行性和整体过程竞争力。