固相萃取与无固相萃取方法在番茄果实与叶片植物激素LC-MS/MS定量中的系统比较

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Comparison of Extraction Methods for the Quantification of Phytohormones From Tomato Fruits and Leaves by LC–MS/MS

　　

植物激素（phytohormones）是化学结构多样的小分子信号转导物质，通过与其同源受体结合调控植物生长发育过程。植物激素丰度的精确时空表征通常采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术实现，因其具有高灵敏度、高特异性且适用于高通量分析流程。然而，UPLC-MS/MS易受基质效应（matrix effect，ME）影响，表现为目标分子在提取和/或色谱分离过程中未能从样品基质中完全分离，以及目标分子电离被增强或抑制，从而降低定量准确性。固相萃取（solid-phase extraction，SPE）被认为可通过纯化粗提物降低植物激素LC-MS/MS定量中的基质效应，但其有效性鲜有系统评估。研究人员采用同位素标记植物激素的提取后加标方法，评估了分别使用tC18和HLB吸附剂的SPE方案以及不含SPE的方案所制备提取物中的基质效应、回收效率（recovery efficiency，RE）和过程效率（process efficiency，PE）。研究涵盖六类结构多样的植物激素以及番茄果实和叶片两种基质，结果显示：未采用SPE的提取方案在各激素类别和基质类型中均未产生显著基质效应；在回收效率、过程效率和变异度方面，采用SPE的方法鲜有确凿证据表明其优于不含SPE的方法。一个值得注意的例外是，使用HLB吸附剂制备的果实提取物中，吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、反式玉米素（trans-zeatin，tZ）和反式玉米素核苷（trans-zeatin riboside，tZR）的变异最小，上述化合物均通过正电喷雾电离（positive electrospray ionization）模式检测。

一、研究背景与问题

植物激素（phytohormones）是化学结构多样的小分子信号转导物质，通过结合同源受体调控植物各类生理过程。植物激素丰度的精确时空表征通常依赖超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，因其灵敏度高、特异性强且适用于高通量分析。然而，UPLC-MS/MS易受基质效应（ME）影响，表现为目标分子在提取或色谱分离过程中未能完全从基质中分离，以及目标分子电离被增强或抑制，从而降低定量准确性。

固相萃取（SPE）被普遍认为是去除粗提物中干扰基质成分、降低基质效应的有效手段，但其实际效能极少被系统评估。此外，SPE方法成本较高且操作繁琐，常需专门设备和试剂，降低通量和可及性。植物激素涵盖生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等多个结构和化学性质迥异的类别，极性、酸碱性和电离行为差异显著，单一溶剂或SPE吸附剂难以同时满足所有激素类别的回收需求。尽管SPE在植物激素提取方案中广泛使用，鲜有研究在同一实验体系内直接系统比较基于SPE与不基于SPE的方法在ME、RE和PE方面的差异，研究者难以判断SPE带来的额外成本、复杂性和通量降低是否能转化为实际定量效果的提升。

二、研究内容与结论

本研究以番茄（Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom）果实和叶片低投入量样品为材料，使用同位素标记植物激素评估三种已发表的植物激素提取方法在六类激素中的ME、RE和PE。三种方法分别为：Cao等描述的使用Sep-Pak tC18柱的SPE方法，Simura等描述的使用Oasis HLB柱的SPE方法，以及Trapp等描述的不含SPE的甲醇单相提取方法。研究共设置三种提取方法、三种组织类型（空白、果实、叶片）和两种标记标准品加标时机（提取前加标、提取后加标），每个组合五个重复，共90个样品。

研究发现，Trapp方法在果实和叶片中均未产生显著ME，而Cao方法在果实中对若干正电喷雾电离检测的激素产生增强型ME，在叶片中对一种负电喷雾电离检测的激素产生增强型ME。三种方法比较中，鲜有强证据表明SPE方法优于单相Trapp方法。此外，使用结构相似但不同的标记标准品进行归一化并不能有效校正不同提取方法间的PE差异。研究结论认为，SPE纯化带来的额外成本和复杂性在番茄果实和叶片的多种激素同步定量中并未得到广泛合理性支持。

三、关键技术方法

研究采用的主要技术方法包括：以2 mg（±10%）冻干番茄果实和叶片粉末为提取输入；三种提取方案分别为Cao法（80%乙腈+1%乙酸提取，经Sep-Pak tC18固相萃取柱纯化）、Simura法（50%乙腈提取，经Oasis HLB固相萃取柱纯化）和Trapp法（80%甲醇单相提取，无SPE步骤）；所有样品提取前加入非标记标准品混合物，标记标准品混合物分别在提取前或提取后加标；采用Waters ACQUITY UPLC联用Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪进行分析，HSS T3色谱柱分离，正负电喷雾电离模式检测；原始数据导入Skyline软件进行峰面积定量；所有统计分析在R中完成，对标记标准品和非标记标准品峰面积分别建立线性回归模型，通过指定对比计算ME、RE和PE比值及95%置信区间。

四、研究结果

3.1 通过标记植物激素标准品计算基质效应

研究采用提取后加标法估算ME，即空白样品（A型）与含基质样品（B型）均在提取后加入等量标记标准品，两者峰面积差异归因于基质存在。结果显示，仅Cao方法产生显著ME：果实中IAA-D₅的ME为2.03（95% CI: 1.19–3.47），tZ-¹⁵N₄的ME为2.00（95% CI: 1.13–3.52），均为增强型ME；叶片中SA-D₄的ME为1.29（95% CI: 1.09–1.55）。Trapp和Simura方法均未检测到显著ME。研究预期简单的Trapp方法因纯化步骤最少可能产生显著抑制型ME，但结果出乎意料。

3.2 通过标记植物激素标准品计算回收效率

RE以C型（提取前加标）与B型（提取后加标）样品峰面积比值计算。果实中，Cao方法对IAA-D₅和tZ-¹⁵N₄、Simura方法对GA₄-D₂和JA-D₅均检测到显著降低的RE；叶片中，Cao方法对ABA-D₆、GA₄-D₂、JA-D₅和SA-D₄、Trapp方法对JA-D₅和SA-D₄检测到显著降低的RE。SPE方法因额外纯化步骤可能导致激素未完全从吸附剂洗脱，RE降低在果实中总体符合预期。

3.3 通过标记植物激素标准品计算过程效率

PE以C型与A型样品峰面积比值计算。Trapp方法提取果实中ABA-D₆和JA-D₅虽ME和RE均不显著，但PE显著低于1；Simura方法提取果实中JA-D₅的RE显著低于1但PE不显著，提示存在未被统计检测到的ME抵消了RE损失；Cao方法提取果实中IAA-D₅和tZ-¹⁵N₄同时存在显著增强型ME和显著降低的RE，但PE与1无显著差异。CV分析显示，IAA-D₅在Cao-果实中CV为47.38%，在Simura-叶片中为71.06%；tZ-¹⁵N₄在Cao-果实中为47.27%，在Simura-叶片中为74.21%，表明SPE方法对正ESI检测的分析物产生异常高的PE变异。

3.4 非标记标准品信号回收——正ESI：IAA、tZ和tZR

空白样品中IAA、tZ和tZR峰面积在三种方法间无显著差异。果实中Cao方法IAA峰面积显著高于Simura方法，与增强型ME一致；tZ和tZR趋势类似但tZ差异不显著。Simura方法在果实中CV最低（IAA为10.30%，tZ为9.72%，tZR为14.95%）。叶片中三种激素峰面积无显著差异，但Cao和Simura方法CV远高于Trapp方法。对于IAA、tZ和tZR，Simura方法在果实中最小化ME和CV，Trapp方法在叶片中最小化ME和CV。

3.5 非标记标准品信号回收——负ESI：ABA、GA₄、GA₃、JA、JA-Ile和SA

SA未加标，空白组无显著差异；果实中Simura组SA显著高于Cao组，且Simura方法CV较高，提示Simura方法对果实SA产生轻微增强型ME。ABA、GA₃和JA在空白和果实中均无显著差异；GA₄和JA-Ile在果实中，Cao组空白峰面积显著低于Trapp或Simura组但果实中不低于二者，Simura组果实峰面积低于空白组，提示抑制型ME。叶片中ABA、GA₃、GA₄、JA和JA-Ile均呈现Cao组显著高于Simura组但不显著区别于Trapp组的模式。总体上，负ESI检测的激素中，Cao方法RE降低且产生增强型ME，Simura方法产生抑制型ME，但各方法间差异较小。

3.6 标记植物激素标准品在控制PE中的表现

将非标记激素峰面积归一化至对应标记标准品后，ABA、GA₄、IAA、JA、SA和tZ在三种方法间均无显著差异，证实匹配标记标准品归一化能有效校正ME和RE差异。然而，GA₃、JA-Ile和tZR分别归一化至结构相近但不同的GA₄-D₂、JA-D₅和tZ-¹⁵N₄后，仍检测到显著的跨方法差异，表明使用结构相似而非完全匹配的标记标准品无法充分校正PE差异。

3.7 植物激素提取方案选择的比较考量

研究结果表明，Cao和Simura方法各在特定激素或组织类型中表现较好，但均未在ME和RE方面持续优于更简单的Trapp方法。对于多种化学性质迥异的激素同步准确定量，Trapp方法在番茄果实和叶片中尤为有利，尤其在通量和成本为重要考量因素时。然而，若研究者专门关注果实中正ESI检测的激素，Simura方法因CV最低而更优。SPE方法表现不稳定的可能因素包括激素化学多样性及其在反相吸附剂上的保留机制、溶剂pH未显式调整等。SPE可能对保护离子源和色谱柱免受长期污染有益，但本研究未对此进行评估。研究局限性包括标记标准品加标浓度未必模拟内源激素水平、2 mg干组织量可能不足以完全反映ME差异等。研究强调建立标准化基准框架（共享参考组织、统一加标水平、一致报告ME/RE/PE）对促进跨研究比较和识别广泛有效的提取参数的重要性。

五、结论

本研究系统比较了三种植物激素提取方法在番茄果实和叶片中的ME、RE和PE。结果显示，不含SPE的Trapp方法在两类组织中均未产生显著ME，而Cao方法在果实中对正ESI检测的若干激素产生增强型ME。三种方法比较中，鲜有证据表明SPE方法优于单相Trapp方法；使用结构相似但不同的标记标准品归一化不能有效校正PE差异。研究结论认为，SPE纯化带来的额外成本和复杂性在番茄果实和叶片的多种激素同步定量中未得到广泛合理性支持。简单、高通量的Trapp方法为多激素同步定量提供了稳健基础，而SPE方法可能引入分析物特异性变异，使跨激素和跨组织比较复杂化。研究同时指出，扩展方法比较至更多组织类型和物种、评估新型SPE吸附剂化学以及建立标准化基准框架，将有助于进一步优化植物激素定量流程。