太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）视网膜增殖模式提示成年神经发生具有古老起源

《Journal of Comparative Neurology》：Patterns of Proliferation in the Pacific Hagfish (Eptatretus stoutii) Retina Suggest an Ancient Origin for Adult Neurogenesis

　　

比较形态学揭示，与有颌类（gnathostomes，有颌脊椎动物）相比，无颌类（cyclostomes，无颌脊椎动物）的眼在结构和组织上存在显著差异。这项工作有助于更好地理解脊椎动物视网膜的进化起源，但某些问题仍未解决。在此，研究人员通过检查视网膜发育来补充该研究路径。研究人员旨在表征代表性无颌类太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）的幼体后（“成年”）视网膜发生（retinogenesis）。由于胚胎获取困难，对盲鳗神经发育的认识受限，但有证据提示其视网膜神经发生持续至个体发育晚期。研究人员使用短暂EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）脉冲检测视网膜中是否存在增殖细胞。随后进行原位杂交（in situ hybridization），以检验有颌类基因的同源基因是否可能具有保守表达模式，并在无颌脊椎动物中指导视网膜发生。在盲鳗视网膜周边（该区域类似有颌类的睫状边缘区（ciliary marginal zone, CMZ））及中央视网膜内检测到EdU⁺细胞。此外，发现盲鳗眼表达若干脊椎动物视网膜神经发生所需的关键基因。其中至少两个基因，OtxA和Rx（retinal homeobox，视网膜同源盒），在增殖性视网膜周边富集。这些发现支持成年视网膜发生是脊椎动物谱系中一个古老且深度保守的性状。

太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）是一种早期分支的无颌类（cyclostomes，无颌脊椎动物），其眼和视网膜形态相较有颌类（gnathostomes，有颌脊椎动物）高度退化：眼小、埋在半透明皮肤下、无晶状体和色素，视网膜分层差。比较形态学研究提示，无颌类眼结构差异可能与祖先性状保留或次生丢失有关；近期观点更支持盲鳗眼在进化中发生退化，但仍保留光感受器、中间神经元和视网膜神经节细胞等分子标志。由于盲鳗胚胎极难获得，其神经发育尤其是胚胎后视网膜发生（retinogenesis）研究受限。因此，研究人员以成体或幼体后盲鳗为对象，检验其退化视网膜是否仍存在增殖，并检验有颌类视网膜发育关键基因同源物是否表达，以探讨脊椎动物成年视网膜神经发生（neurogenesis）的进化起源。

研究人员采集太平洋盲鳗，给予短暂EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）脉冲，检测视网膜增殖细胞，并结合原位杂交（in situ hybridization）检测OtxA和Rx（retinal homeobox，视网膜同源盒）表达；同时进行生物信息学、共线性（synteny）和系统发育分析。结论是，胚胎后盲鳗视网膜仍含增殖细胞，主要富集于周边类似睫状边缘区（ciliary marginal zone，CMZ）的区域，也存在于中央视网膜；盲鳗眼表达多个脊椎动物视网膜神经发生关键基因，OtxA和Rx在增殖性周边富集。该研究支持成年视网膜发生是脊椎动物谱系中古老且深度保守的性状，并为在盲鳗中研究视网膜神经发生提供入口。

关键方法概述：样本来自加拿大不列颠哥伦比亚省Vancouver Island西海岸Barkley Sound、Bamfield Marine Sciences Center附近，以Korean cone trap捕获并暂养。10只盲鳗经腹腔注射EdU，24 h后取眼和脑组织，4% PFA固定。眼组织冷冻切片后进行EdU检测，DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚）复染，共聚焦成像；对3只个体（EdU 5、EdU 6、EdU 8）的21张视网膜切片进行EdU⁺细胞分区定量，以双因素方差分析和Tukey多重比较分析。另用斑马鱼眼作形态比较，并以DAPI和Phalloidin-546标记。生物信息学上，通过tBLASTn（translated nucleotide BLAST，翻译核苷酸BLAST）、反向BLAST、基因共线性与系统发育分析鉴定同源物；制备OtxA和Rx核糖探针，进行原位杂交及荧光原位杂交。

研究结果如下。

3.1 胚胎后盲鳗视网膜继续增殖。通过24 h EdU脉冲和EdU检测，研究人员在6只处理动物中均检测到EdU⁺细胞，未处理动物无此类标记。多数视网膜切片含一个或多个EdU⁺细胞，常成簇位于视网膜周边，也见于中央。对3只个体21张切片定量，57% EdU⁺细胞位于最周边区域1，区域1显著高于其余五区（p<0.0001）；个体因素不显著，个体与区域存在显著交互。将视网膜分为CMZ样区和中央区后，两者EdU⁺细胞数无显著差异（p=0.73）。结论：胚胎后盲鳗视网膜持续增殖，周边富集，中央也有增殖细胞。

3.2 生物信息学与系统发育分析支持盲鳗视网膜转录本与七鳃鳗及有颌类关键视网膜发育基因同源。通过tBLASTn搜索盲鳗基因组和RNAseq数据集，结合反向BLAST、基因共线性分析，研究人员发现盲鳗具有若干有颌类视网膜发育必需基因的同源物，并优先分析Rx和OtxA；这些基因与有颌类基因同源性得到共线性支持。结论：盲鳗保留关键视网膜发育基因同源物。

3.3 盲鳗视网膜表达视网膜增殖与神经发生标志物。通过原位杂交，OtxA在盲鳗视网膜多处表达，包括视网膜非色素上皮（retinal non-pigmented epithelium，RnPE）强表达、视网膜周边CMZ、内核层（inner nuclear layer，INL）和可能光感受器层；Rx在INL及可能周边表达。结论：盲鳗视网膜表达与增殖和神经发生相关的标志物，OtxA和Rx表达模式与有颌类部分保守。

讨论部分总结如下。

4.1 尽管具有退化特征，成年盲鳗视网膜仍继续增殖。EdU标记显示超过50%增殖细胞位于边缘，类似CMZ；眼大小随体形增加，周边表达Pax6，周边上皮形态保守，中央细胞更分化，OtxA和Rx周边表达，均支持CMZ样结构。CMZ在硬骨鱼和两栖类最典型，鸟类较少，哺乳类基本缺乏，鲨鱼近期发现；一项研究提示七鳃鳗可能缺乏该结构。盲鳗维持活跃视网膜生长令人意外，作者提出可能视网膜有其他功能如昼夜节律调节，或持续增殖属幼态持续。中央EdU⁺细胞身份未知，可能与硬骨鱼成熟视网膜增殖细胞一致，可能为Müller胶质样细胞、小胶质或血细胞；采集深度80 m至表面可能造成光暴露或损伤。建议将EdU与Notch1或Olig2原位杂交结合以确认周边性质。

4.2 盲鳗具有有颌类视网膜发育关键基因同源物。基因组和RNAseq显示盲鳗眼表达多个关键基因，包括Rx和Otx基因（OtxA、OtxB、OtxC、OtxD四个旁系同源基因）。在有颌类，Rx维持视网膜祖细胞，Otx参与光感受器和双极细胞等分化。

4.3 Otx2与Rx的盲鳗同源物表达于视网膜周边和内核层。OtxA强表达于RnPE，与哺乳动物视网膜色素上皮（retinal pigmented epithelium，RPE）中Otx2模式相近；还表达于光感受器层、INL和周边。Otx2在有颌类指定光感受器和双极细胞并维持光感受器健康。若INL标记细胞为双极细胞，则与有颌类相似，需PKC-ɑ双标确认。表达数据不能断言OtxA促进视网膜发育；但周边OtxA提示部分表达发生于新形成神经元。Yamamoto等对日本七鳃鳗（Lethenteron camtschaticum）的研究显示，成体OtxA仅见于光感受器层，并认为Otx2双极指定作用可能仅见于有颌类；盲鳗OtxA多视网膜层表达不支持这一概括。Rx表达最强在INL，类似斑马鱼Rx3；周边一侧有表达，对侧不清。

结论翻译：盲鳗是了解较少的早期分支脊椎动物，具有奇特而迷人的眼形态。研究其发育可能揭示脊椎动物眼和视网膜进化起源中先前隐藏的线索。研究盲鳗最大限制之一是获取胚胎的后勤困难。然而，本研究与先前研究一起，揭示盲鳗视网膜存在增殖区，研究人员将其解释为CMZ样结构。这为探索盲鳗视网膜神经发生创造了途径。CMZ的存在也提示，胚胎后神经发生在脊椎动物谱系中的起源可能比先前认为的更古老。