早期生成板下神经元（SpNs）大部分持续存在为成年小鼠新皮层第6b层（L6b）神经元：饱和EdU出生日期标记与全脑透明化定量证据

《Journal of Comparative Neurology》：Most Early-Born Subplate Neurons Persist as Layer 6b Neurons in the Adult Mouse Neocortex

　　

板下神经元（subplate neurons, SpNs）是哺乳动物新皮层中早期生成的神经元，在皮层发育中发挥关键作用。目前普遍认为，SpNs主要因出生后细胞死亡而丢失，仅少数残余细胞贡献成年新皮层第6b层（layer 6b, L6b）神经元，但SpNs持续存在为L6b神经元的程度仍很大程度上未知。为解决该问题，研究人员在24 h内采用多次乙炔基脱氧尿苷（ethynyl deoxyuridine, EdU）注射进行全面的出生日期分析，从而精确追踪成年小鼠新皮层中SpNs的存活与分布。研究人员进一步基于采用3D组织透明化（3D tissue clearing）定量的板下区（subplate）和L6b总体积，估算了SpNs和L6b神经元的总数。研究结果显示，L6b神经元中相当大比例是SpNs的残余，并包含类似出生后时期的多样亚型（SpNs：319,588 ± 49,263；L6b神经元：316,720 ± 11,268）。该研究提供直接证据表明，成年小鼠新皮层中大多数L6b神经元起源于神经发生最早阶段的SpNs，并终生持续存在。

论文解读：早期生成板下神经元大部分持续存在为成年小鼠新皮层第6b层神经元

哺乳动物新皮层具有典型六层结构，其中第6b层（layer 6b, L6b）是位于白质（white matter, WM）正上方的薄层细胞带，可向第1层、第5a层及内侧后丘脑核等多个皮层内和皮层外区域投射。新近证据显示，L6b神经元参与睡眠-觉醒状态调节和认知加工，例如仅L6b神经元在全新皮层范围内对Orexin B产生反应，内嗅L6b神经元投射至海马并参与空间编码和记忆。因此，尽管L6b神经元密度较低，其在成年新皮层回路的信息整合中具有重要作用。然而，L6b神经元的发育起源长期不清。发育中新皮层最深层对应成年L6b，称为板下区（subplate, SP），其中所含神经元即板下神经元（subplate neurons, SpNs）。SpNs与Cajal–Retzius（CR）细胞共同构成前板，是最早出生的皮层神经元，参与迁移中兴奋性神经元的多极-双极转变，并作为丘脑皮层轴突的暂时靶标，引导其到达第4层以建立成熟丘脑皮层回路。尽管SpNs与L6b神经元占据相同解剖位置，但传统观点认为二者因发育阶段功能差异而不同，并认为SpNs出生后大量死亡，仅少数残余成为L6b神经元。以往大鼠出生日期研究提示部分SpNs可存活至成年并贡献L6b，但这些分析依赖单脉冲放射性标记，仅能捕获约4 h窗口并标记小部分群体，缺乏定量、全皮层分辨率。该问题还受三个技术限制：SpNs分子异质性且缺乏通用标记；出生后新皮层和SP显著扩张使结构分布难以评估；单脉冲胸腺嘧啶类似物注射无法可靠标记全部早期出生群体。因此，研究人员需要更饱和的出生日期标记和全脑体积定量方法重新评估SpNs存活。

研究人员开展了系统的出生日期追踪和全脑定量研究。研究人员在E10.5–E11.5每4 h注射EdU六次进行E11全标记（E11 whole labeling, E11wl），在E11.5–E12.5每6 h注射EdU四次进行E12全标记（E12 whole labeling, E12wl），并与单次E11.5或E12.5注射比较。研究人员使用Lpar1-EGFP转基因小鼠界定SP/L6b，结合CUBIC组织透明化和光片荧光显微镜（light-sheet fluorescence microscopy, LSFM）进行全脑成像和3D重建，测量SP、L6b、边缘区（marginal zone, MZ）/第1层（layer 1, L1）及新皮层体积；同时用神经元核抗原（NeuN）免疫染色计数神经元，用EdU、CTGF、NR4A2、TBR1和Caspase-3等标记分析分子特征和程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）。样本来源为Lpar1-EGFP雄性小鼠与野生型ICR雌性小鼠（LSC, Japan）交配，实验经东京都医学研究所动物委员会批准；分析阶段包括E17.5、P0、P14和8周。研究结论是：大多数早期出生SpNs持续至8周，L6b神经元是早期出生SpNs的幸存者，出生后SpN数量无显著下降；SpN密度下降主要来自新皮层扩张而非细胞死亡。该研究修正了SpNs出生后大量消失的传统观点，并提示成年L6b神经元大部分源于神经发生最早阶段的SpNs，对理解成年皮层回路形成具有重要意义。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员采用饱和EdU出生日期标记，在E10.5–E11.5每4 h六次、E11.5–E12.5每6 h四次注射，以捕获早期出生SpNs；使用Lpar1-EGFP小鼠界定SP/L6b；采用CUBIC组织透明化、LSFM全脑成像和3D重建测量SP/L6b、MZ/L1及新皮层体积；通过冠状切片免疫组化计数NeuN⁺、EdU⁺细胞及CTGF、NR4A2、TBR1、Caspase-3表达；并用全新皮层连续切片直接计数E12wl EdU⁺ L6b神经元以验证估算。样本为Lpar1-EGFP与野生型ICR小鼠交配所得小鼠，涵盖E17.5、P0、P14和8周。

研究结果如下。

4.1 EdU Administration Over 24 H Sufficiently Captures Early-Born SpNs：研究人员将SP神经发生期分为E10.5–E11.5和E11.5–E12.5，分别进行六次和四次EdU注射。与单次注射相比，P0时单次E11.5注射的EdU⁺神经元限于SP和MZ，而E11wl在SP中的EdU⁺神经元密度约高6倍，E12wl约高5倍。E17.5和P0可见EdU⁺ SpNs和CR细胞；P14时MZ几乎无EdU⁺细胞，但L6b仍有许多EdU⁺神经元，深层仅少量标记。结论是多次EdU注射可充分标记早期出生SpNs，且SpNs与CR细胞出生后减少方式明显不同。

4.2 Most L6b Neurons Are Generated Between E10.5 and E12.5：8周时E11wl和E12wl EdU⁺细胞特异位于整个新皮层的L6b。EdU⁺区域厚度在前部约70 μm、躯体感觉区约50 μm、后部约40 μm，平均50.6 μm。E11wl EdU⁺神经元占L6b神经元34.64% ± 13.23%，E12wl占64.01% ± 6.65%，合计超过90%的成年L6b神经元在E10.5–E12.5生成。WM中EdU⁺/NeuN⁺细胞很少。结论是早期SpNs持续为L6b神经元并分布于成年新皮层L6b全层。

4.3 L6b Neurons Have Distinct Molecular Characteristics From SpNs：研究人员对SpN标记CTGF、NR4A2和L6标记TBR1进行免疫染色。CTGF在E11wl EdU⁺中为84.54% ± 4.26%，在E12wl中为65.33% ± 5.18%；CTGF⁺ & EdU⁺/CTGF⁺在E11wl为40.94% ± 6.17%，E12wl为63.35% ± 4.35%。NR4A2在EdU⁺中E11wl为23.95% ± 6.90%，E12wl为43.66% ± 13.46%；在NR4A2⁺中E11wl为25.18% ± 3.93%，E12wl为73.93% ± 6.89%。TBR1在EdU⁺中E11wl为88.62% ± 2.21%，E12wl为79.60% ± 5.13%；在TBR1⁺中E11wl为35.22% ± 15.63%，E12wl为65.86% ± 7.39%。结论是存活SpNs与新生SpNs共享分子身份，表达SP标记和部分L6标记；较晚出生阶段SpNs更倾向表达NR4A2和TBR1。

4.4 Programmed Cell Death (PCD) Is Not the Main Cause of the Decline in SpN Density：研究人员用NeuN免疫染色发现出生后第一周SP/L6b神经元密度下降；为检验PCD，研究人员在P4、P7、P10和P14用Caspase-3染色，见新皮层包括SP有Caspase-3⁺细胞，但总数很低，每视野仅1–2个，SP与L6a无显著差异；SP中约60% Caspase-3⁺细胞共表达NeuN，约40%不表达。结论是PCD在出生后SpN群体减少中作用有限，SpN密度下降不能完全由细胞死亡解释。

4.5 Whole-Brain Imaging Reveals Minimal Elimination of SpNs：研究人员用Lpar1-EGFP界定SP/L6b，经CUBIC透明和LSFM成像重建。SP在P0体积为0.57 ± 0.03 mm³，8周L6b体积为4.22 ± 0.11 mm³，增大约7.4倍。NeuN⁺密度从P0的11,016.42 ± 1232.68 cells/mm²降至8周的2256.68 ± 107.25 cells/mm²。据此估算SpNs总数为319,588 ± 49,263，L6b神经元总数为316,720 ± 11,268，仅减少0.9%，即约2868个细胞。新皮层灰质体积从P0的11.29 ± 1.04 mm³增至8周的135.13 ± 4.08 mm³，约12.0倍，而SP/L6b仅约7.4倍。结论是SpN密度下降主要归因于新皮层扩张，而非显著的细胞丢失。

4.6 Layer-Specific Estimation of Neuron Numbers Efficiently Reflects a Decrease：研究人员以CR细胞/L1神经元验证估算方法。E11 EdU⁺ L1细胞在P14和8周减少。MZ/L1体积从P0的1.96 ± 0.24 mm³增至8周的13.50 ± 1.75 mm³，约7倍；NeuN⁺密度从P0的2745.60 cells/mm²降至8周的242.83 cells/mm²，降低11.3倍。估算MZ/L1神经元从269,411降至106,153，减少约61%。结论是该层特异估算方法能反映真实神经元总数减少，并可排除出生后新皮层扩张的混杂影响。

讨论部分总结：研究人员指出，SpNs长期被认为出生后消失，但本研究通过长期出生日期标记和组织透明化证明，大量早期出生SpNs存活至成年并构成L6b神经元的重要部分；从P0到8周，SP/L6b神经元总数变化很小，且成年L6b神经元表达经典SpN标记，支持其持续存在并超越胚胎期功能。方法存在两个限制：CUBIC处理可能造成组织扩张或变形，虽与公开MRI测量总体差异较小，但不能完全校正；直接计数E12wl EdU⁺ L6b神经元约占估算成年L6b总数的一半，而躯体感觉皮层中E12wl EdU⁺/NeuN⁺比例约64%，提示出生日期定义的SpN/L6b群体在新皮层分布不均，后部密度略高。未来结合全组织透明和遗传标记可直接枚举全部SpNs。讨论还指出，出生日期分析不能确定SpNs精确起源；有研究提示E10–E11 SpNs可能主要来自RMTW，E12 SpNs来自脑室区，E12wl更多表达NR4A2提示出生日期和起源相关亚型。成年L6b神经元参与视觉、听觉等功能回路，且本研究显示EdU⁺ L6b神经元表达CTGF，提示存活SpNs参与成熟功能回路；但其从胚胎SpNs向成年L6b神经元转变的机制及功能意义仍待研究。物种方面，猫新皮层发育中SpNs约减少90%，人新皮层SP发生显著变化，提示可能存在物种特异性遗传网络。

研究结论部分翻译：总之，该研究揭示，在胚胎发育中发挥关键作用的SpNs能够存活并参与小鼠的成年神经元回路。仍需进一步实验以阐明存活SpNs作为成年新皮层L6b神经元的功能意义和活动。