《Microchemical Journal》：Smartphone-readable time-resolved fluorescence microsphere-based nucleic acid lateral flow assay for
Streptococcus suis via Cross-Priming Amplification
编辑推荐：
•开发一种整合时间分辨荧光微球（TRFM）、交叉引物扩增（CPA）和免疫层析试纸条（ICTS）的核酸诊断方法。•超灵敏检测：达到1.7拷贝/μL的检测限（LOD）。•快速工作流程：通过等温扩增在1小时内实现猪链球菌的现场检测。•智能定量：采用便携式智能手机读数器进行半定量分析
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开发一种整合时间分辨荧光微球（TRFM）、交叉引物扩增（CPA）和免疫层析试纸条（ICTS）的核酸诊断方法。
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超灵敏检测：达到1.7拷贝/μL的检测限（LOD）。
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快速工作流程：通过等温扩增在1小时内实现猪链球菌的现场检测。
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智能定量：采用便携式智能手机读数器进行半定量分析和实时数据采集。
引言
猪链球菌（猪链球菌）感染是一种全球范围内流行的动物源性传染病，影响猪和人类[1]，[2]。2017年至2019年间，在中国15个省份的病猪中分离出177株猪链球菌，证实其在猪群中广泛存在[3]。2021年泰国再次发生猪链球菌感染暴发，共报告88例疑似病例，其中19例确诊，两名患者死亡[4]。此外，这种动物源性疾病也在荷兰、阿根廷、印度尼西亚和日本有记录[5]。猪链球菌感染会引起一系列疾病，包括猪和人类的脑膜炎、关节炎、败血症和心内膜炎。该病原体给养猪业带来重大经济负担，并构成严重的公共卫生威胁[6]。猪链球菌引起的感染属于典型的职业相关感染，此类暴发事件经常发生在资源有限的地区。为了有效预防和控制猪链球菌相关感染，早期快速的现场检测方法至关重要。
然而，适用于现场筛查的实用诊断工具仍然十分有限。目前，猪链球菌的诊断主要依赖于微生物培养和血清学检测。这些方法耗时长、操作过程复杂，且缺乏现场应用所需的灵敏度[7]。虽然聚合酶链反应（PCR）是一种重要的分子技术，但其对专业实验室和昂贵设备的依赖限制了其在现场环境中的应用[8]。全基因组测序（WGS）技术虽然对暴发监测有价值，但由于时间和成本过高，不适用于大规模筛查[9]。因此，迫切需要一种快速、经济、可靠且特异的现场检测方法用于诊断人类猪链球菌感染，这对于确保肉品安全、控制暴发和减少经济损失至关重要。
近年来，研究人员越来越关注基于适配体的生物传感器[10]，[11]和电化学传感器用于方法开发研究[12]，[13]。基于适配体的比色传感器[14]和电化学传感器[15]，[16]也已用于猪链球菌的检测。适配体是通过人工筛选获得的单链寡核苷酸，作为传统抗体的替代识别元件[17]。它们具有变异小、易于化学修饰和优异的热稳定性等优点，能够实现特异性捕获目标物[18]。当与纳米材料辅助的信号放大策略结合时，电化学生物传感器可以将生物识别事件转换为可测量的电信号，实现对菌落形成单位（CFU）的超低检测限[15]。然而，针对猪链球菌的成熟且易得的检测平台仍然有限。此外，电极制备流程复杂、固定条件苛刻、易受基质干扰以及依赖专业分析设备等挑战阻碍了其实用现场应用[19]。因此，兼顾灵敏度、操作简便性和便携性的即时检测（POCT）平台对于猪链球菌的快速现场诊断仍然十分迫切。
为了克服传统核酸检测固有的仪器依赖性，等温核酸扩增技术在POCT应用中受到了广泛关注。与PCR和WGS相比，等温核酸扩增在快速现场检测方面获得了相当大的应用。这些方法只需要基本的加热设备，如水浴锅，从而避免了对复杂昂贵仪器的需求[20]，关键等温技术包括环介导等温扩增技术（LAMP）、滚环扩增（RCA）、链置换扩增（SDA）和交叉引物扩增（CPA）等。其中，CPA提供了一种特别有吸引力的解决方案。其简化的反应方案避免了LAMP特有的复杂引物组或RCA所需的环状模板制备。这种简化方法降低了成本和复杂性，同时保留了对病原体检测的高特异性和灵敏度[21]。
对于POCT核酸扩增策略而言，选择合适的信号读取格式同样至关重要。侧向流免疫测定是一种基于抗原-抗体相互作用的商业成功快速检测技术。与用于核酸检测的凝胶电泳相比，核酸侧向流检测提供了简便的操作和直观的结果解读，使其成为临床POCT的理想选择[22]，[23]。为了开发一种作为猪链球菌检测中PCR可靠且灵敏替代品的核酸扩增产物检测试纸条，选择合适的纳米材料是关键策略。时间分辨荧光微球（TRFM）特别合适，因为它们具有优异的结构稳定性、高标记效率、长荧光寿命和强信号强度，通过时间-波长双分辨分析共同最小化背景干扰[24]，[25]，[26]，[27]。目前，TRFM免疫层析试纸条（ICTS）已广泛应用于检测各种目标，从小分子（叶酸[28]、真菌毒素[29]、莫能菌素[30]）到病原体（猴痘病毒[31]和布氏杆菌病[32]）。
综上所述，现有的猪链球菌诊断方法在分析性能和田间适用性之间存在固有妥协。虽然等温扩增与侧向流平台的结合极大地推动了POCT的发展，但大多数报道的系统仍局限于定性检测，无法灵敏识别低拷贝数样本，阻碍了早期感染筛查。此外，传统肉眼读数容易受到主观解读误差的影响，进一步限制了这些检测在资源有限场景中的实际现场部署。因此，迫切需要一种稳健的POCT策略，整合高效等温扩增、高性能荧光报告基团和智能手机辅助定量读数，以解决上述技术局限。
基于这些考虑，我们提出了一种用于检测猪链球菌的快速定量核酸免疫层析试纸条（NAICTS）核酸诊断平台。该平台整合了更灵敏的TRFM和高效等温扩增技术CPA，并结合智能手机读数进行灵敏的视觉现场检测。它为临床环境中的POCT提供了一种简单、便携且经济有效的解决方案，具有三个关键优势。(1) 在63°C下40分钟内高效扩增目标物。(2) 高灵敏度，视觉检测限（LOD）低至1.7拷贝/μL，实现早期感染检测和监测。(3) 通过连接智能手机的便携式NAICTS读数器实现现场能力，允许实时视觉读数，无需复杂的实验室设备。与常规PCR相比，该方法提供了更高的灵敏度、更快的周转时间和更大的便携性，使其成为资源有限环境中快速筛查的理想工具。总体而言，这种诊断方法为猪链球菌的快速现场检测提供了一种可靠的解决方案，可能改善人类感染的早期诊断和监测。
章节片段
样本和基因组DNA提取
研究中使用的细菌菌株保存在本实验室，详细信息汇总于表S1。严格按照TIANamp细菌DNA试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国）提供的标准方案从这些菌株中提取基因组DNA。基因组DNA模板的拷贝数根据基因组大小使用以下公式计算：
TRFM-CPA-NAICTS策略
便携式TRFM-CPA-NAICTS用于猪链球菌定量检测的检测原理如图1所示。首先，如图1A所示，通过使用EDC/NHS将抗生物素抗体修饰到TRFM纳米颗粒上制备TRFM-抗体（Ab）探针。接下来，图1B概述了CPA过程。CPA检测利用生物素和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的引物产生双链DNA扩增产物。这些产物同时被生物素和FITC标记。最后，
结论
开发了一种快速、灵敏且智能手机辅助的TRFM-CPA-NAICTS平台，以实现猪链球菌的高灵敏度和现场检测。通过合理整合CPA、TRFM和ICTS的优势，该方法显著放大了目标信号并将检测时间缩短至1小时以下。将所有传感元件整合在单条试纸条上实现了显著微型化的检测系统，便于便携式现场操作。该
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乔斌：撰写–初稿，方法学，调查研究，资金获取，数据管理，概念构思。曹佩佩：撰写–初稿，验证，方法学，调查研究，形式分析。陈志凌：可视化，调查研究。赖祥德：验证，调查研究。陈倩：资源，调查研究。吴强：撰写–审阅与编辑，监督，资源，方法学，资金获取，概念构思。何豫：撰写–审阅与编辑，验证，
资助
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利益冲突声明
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