基于单细胞RNA测序的三刺鱼不同细胞类型进化速率差异研究

《Molecular Ecology》：Rates of Evolution Differ Between Cell Types Identified by Single-Cell RNAseq in Threespine Stickleback

进化速率因基因而异。一些广泛的基因类别高度保守，随时间推移分歧很小，而另一些则持续受到选择压力并在种群或物种间高度分歧。但这种比较进化研究依赖于基因本体论（Gene Ontology, GO）类别，而这些类别很少在研究的目标物种中得到验证。一种替代方法是利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNAseq）确定物种特异性的基因功能，该方法可识别细胞类型及其各自表达的标志性基因。本研究将scRNAseq与进化基因组学相结合，探究某些细胞类型（利用其标志性基因）是否比其他类型的细胞表现出更快的进化分歧（研究对象为三刺鱼这一新兴模式生物的肠道、头肾、肝脏和鳃组织）。通过融合scRNAseq与群体基因组数据，研究人员发现细胞类型在其标志性基因的进化速率上存在差异，这通过多个种群间的等位基因频率分歧（FST）以及驱动物种间序列差异的长期选择效应（dN/dS比值）来衡量。中性粒细胞、B细胞和成纤维细胞的标志性基因表现出升高的FST值，而肠道中的嗜酸性粒细胞和头肾中的血栓细胞的FST值低于1000个随机基因的平均水平（dN/dS显示出相似的结果）。基因在scRNAseq共表达网络中的位置（通过图论中心性指标衡量）在不同细胞类型间也存在差异，并且接近中心性较高的基因倾向于具有更高的FST值。这些结果突显了将scRNAseq技术与进化群体基因组数据相结合的价值，并揭示了定义免疫细胞类型的基因尤其经历了快速的进化。

一、研究背景与科学问题

比较进化遗传学研究已经明确，不同基因的进化速率存在差异。一些基因类别高度保守，受负选择作用清除新突变，而另一些基因则持续受到正选择作用。例如，人类群体间的分歧在免疫基因中尤为迅速。然而，这类研究通常依赖粗放的基因本体论分类来划分基因功能，这可能无法有效反映基因间的真实功能关系。这一局限性对于非模式生物尤为突出，因为它们的基因本体论注释通常是从亲缘关系遥远的模式生物推断而来。为解决这一问题，本研究提出了一种替代方案：将新兴的单细胞RNA测序技术与进化基因组学相结合。通过在三刺鱼这一新兴进化遗传学模式生物中应用scRNAseq，研究人员旨在鉴定不同组织中的细胞类型及其标志性基因，进而检验不同细胞类型的基因是否表现出不同的进化速率，并探讨基因共表达网络结构对进化速率的影响。

二、研究方法概述

研究人员首先对实验室饲养的三刺鱼的肠道、头肾、肝脏和鳃组织进行单细胞RNA测序，其中头肾样本来自不列颠哥伦比亚省Sayward Estuary、Roberts Lake和Gosling Lake三个种群的野生亲本后代。通过聚类分析和差异表达基因鉴定，确定了各组织的细胞类型及其细胞类型特异性基因。随后，利用已发表的群体池测序数据，计算了来自23个淡水湖和3个海洋群体的三刺鱼等位基因频率，并估算了海洋-淡水群体间的平均F_ST值作为微进化分歧指标。同时，通过比较三刺鱼与其他三种棘背鱼目物种的一对一直系同源基因，计算了dN/dS比值和系统发育树长作为宏观进化速率指标。此外，基于单细胞转录组数据构建了基因共表达网络，并计算了度中心性、特征向量中心性、Katz中心性和接近中心性等图论指标，用于分析基因网络位置与进化速率的关系。

三、研究结果

3.1 单细胞RNA测序获得的细胞数和每细胞读数

从肠道组织获得12,278至30,789个估计细胞，头肾获得8,161至19,382个细胞，肝脏获得8,436至9,662个细胞，鳃获得7,327至9,089个细胞。肠道中每细胞中位基因数为257至779，头肾为307至707，肝脏为309至372，鳃为327至380。

3.2 UMAP和t-SNE聚类分析

UMAP和t-SNE聚类分析在肠道中鉴定出23个细胞簇，头肾中24个，肝脏中4个，鳃中5个。通过与已有研究比对标志性基因，研究人员在肠道中成功鉴定了11个细胞类型，包括造血细胞、干细胞、嗜酸性粒细胞、腺泡细胞、肠上皮细胞、红细胞、原红细胞、肠细胞、中性粒细胞、成髓细胞和单核细胞。肝脏中鉴定出中性粒细胞、红细胞、肝细胞和库普弗细胞四个细胞类型。鳃中鉴定出红细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞和上皮细胞五个细胞类型。

3.3 微进化分歧

研究发现，基因水平的平均F_ST在不同细胞类型间存在显著差异。通过嵌套线性混合模型分析，细胞类型对基因F_ST有显著影响。中性粒细胞、B细胞和成纤维细胞的标志性基因表现出显著升高的F_ST值，表明这些免疫相关细胞类型的基因经历更强的分歧选择。相比之下，肠道中的嗜酸性粒细胞和头肾中的血栓细胞的标志性基因F_ST值显著低于1000个随机基因的平均水平，提示这些细胞类型的基因可能受到稳定化选择的约束。

3.4 基因网络连接性

通过分析基因共表达网络，研究人员发现接近中心性与基因F_ST之间存在显著的正相关关系，表明在网络中与其他基因连接更紧密的基因倾向于经历更快的进化分歧。基因网络中心性在不同细胞类型间也存在变异。然而，进一步的机器学习模型分析显示，网络特征单独不足以充分解释观察到的进化速率变异。

3.5 其他选择指标

dN/dS比值分析显示，细胞类型间存在显著差异。在肝脏中，干细胞和嗜酸性粒细胞的dN/dS最低，而肠细胞、腺泡细胞和成红细胞的dN/dS最高。在头肾中，造血干细胞和自然杀伤细胞的dN/dS低于血小板和中性粒细胞。值得注意的是，微进化指标（F_ST）与宏观进化指标（dN/dS和树长）之间未发现显著相关性，表明在短期内快速分化的基因并不一定在长期物种间进化中积累更多替换。

四、讨论与结论

本研究展示了将单细胞RNA测序技术与群体基因组学数据相结合的价值，为理解基因组范围内的进化速率变异提供了新的视角。传统的基因本体论分类通常源自少数模式生物，可能无法准确反映非模式生物中基因的真实功能。而scRNAseq可以直接在目标物种中创建细胞图谱，为每个细胞簇提供特异性基因集，从而替代GO分类用于进化研究。

研究结果表明，免疫相关细胞类型（如中性粒细胞、B细胞和成纤维细胞）的标志性基因进化更快，这与宿主-病原体军备竞赛导致的持续选择压力相一致。相反，某些细胞类型（如肠道嗜酸性粒细胞和头肾血栓细胞）的基因则表现出较低的进化速率，可能受到稳定化选择的约束。此外，基因在共表达网络中的位置与进化速率之间存在关联，但网络特征本身并不能完全解释进化速率的变异。

一个重要发现是微进化分歧（F_ST）与宏观进化速率（dN/dS和树长）之间的解耦。这种解耦的一个可能原因是频率依赖性选择，它可以在短时间内导致等位基因频率的快速波动，但长期来看并不产生净遗传变化。

总之，本研究证实了免疫功能的易变性，并为将scRNAseq技术应用于进化基因组学提供了范例。未来通过增加更多物种和组织类型的研究，将有助于进一步理解细胞类型鉴定、基因功能以及跨基因进化速率的驱动因素。