《Molecular Ecology Resources》：Distinct Environmental DNA States Reveal Biodiversity and Transport Patterns Across Alpine Watersheds
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环境DNA（environmental DNA, eDNA）以三种状态存在：膜结合态（membrane-bound）、吸附态（adsorbed）和溶解态（dissolved）。这些状态在持久性与降解方面存在差异，强烈影响 eDNA 数据的解释。尽管如此，它们很
环境DNA（environmental DNA, eDNA）以三种状态存在：膜结合态（membrane-bound）、吸附态（adsorbed）和溶解态（dissolved）。这些状态在持久性与降解方面存在差异，强烈影响 eDNA 数据的解释。尽管如此，它们很少从环境样品中被分离并独立分析。研究人员开发了一种状态分选（state-sorting）流程以分离并分析这些状态，并将其应用于来自八个湖泊流域中 58 条溪流的 221 个站点的样品，分别使用 COI 和 ITS 宏条形码（metabarcoding）靶向后生动物和植物，以揭示生物多样性内容和传输动态的差异。研究结果表明，三种状态均包含后生动物 eDNA 的共享和独特分类多样性。然而，植物 eDNA 仅在膜结合态中被检测到。对于后生动物，膜结合态 eDNA 包含观测到的扩增子序列变异（amplicon sequence variants, ASVs）的 87.8%，远高于吸附态（37.2%）和溶解态（20.5%）。仅膜结合态 eDNA 显示出下游传输的证据，但其程度因当地水文而在不同流域间变化。尽管上游 eDNA 被传输至溪流–湖泊汇流处，湖泊表层样品显示群落组成发生周转。阐明膜结合态 eDNA 在湖泊中的归趋将增强从湖泊样品进行集水区水平检测以及理解湖泊水动力学。在评估的环境参数中，水温与站点间群落组成变化的相关性最强。大多数既往研究可能通过无意中靶向膜结合态而捕获了其样品中大部分 eDNA 多样性。本研究证明 eDNA 状态分选的效用，但方法需要进一步改进。独立分析各状态可改善 eDNA 数据的解释，并阐明控制 eDNA 归趋和传输的过程。
研究人员围绕环境DNA（environmental DNA, eDNA）在水生态系统中的状态与传输开展研究。eDNA 已知以膜结合态（membrane-bound）、吸附态（adsorbed）和溶解态（dissolved）存在，三者在持久性与降解速率上不同，但以往很少从同一环境样品中分离并独立分析，导致对 eDNA 数据解释、生物多样性检测和传输行为的理解受限。水从景观流向湖泊时会收集陆源和水生来源 eDNA；若 eDNA 在降解前被传输，可能在湖泊等“eDNA 热点”累积。然而，溪流中 eDNA 传输既提供集水区尺度生物多样性信息的机会，也带来难以区分本地释放与上游传输的挑战。eDNA 的沉降、降解和稀释受水文参数及其自身状态影响。因此，研究人员开展本研究以检验 eDNA 状态是否影响捕获的生物多样性信息及下游传输，并评估湖泊表层是否含入流溪流 eDNA。研究人员在瑞士八个湖泊流域、58 条溪流、221 个站点采集表层水，开发状态分选（state-sorting）流程，将同一水样分为三种状态，并分别用 COI 和 ITS 宏条形码（metabarcoding）分析后生动物和植物。研究结论表明，三种状态携带不同生物多样性信息；膜结合态含大多数独特 ASVs，并且是植物 eDNA 唯一可检测状态；仅膜结合态显示下游传输证据；湖泊表层与入流群落组成发生周转。该研究强调过滤法可能已捕获多数 eDNA 多样性，同时独立分析 eDNA 状态有助于改善数据解释并理解其归趋与传输。
主要关键技术方法：研究人员开发 eDNA 状态分选流程，对瑞士八个湖泊流域、58 条溪流、221 个站点来源水样进行处理，将膜结合态、吸附态和溶解态分离；使用 COI 与 ITS 宏条形码分别靶向后生动物和植物；测序数据采用 UNOISE 与 DADA2 流程生成 ASVs，并结合步骤上游样本顺序（Stepwise Upstream Sample Order, SUSO）、α/β多样性、PERMANOVA（置换多元方差分析）、NMDS（非度量多维尺度）及环境向量拟合分析传输与群落格局。样本队列来源为八个瑞士湖泊流域，流域内样品在一周内采集。
3.1 eDNA State-Dependent DNA Yield and Diversity：在成功测序三种状态的 138 个配对站点中，DNA 产量在状态间差异显著，溶解态最高，膜结合态次之，吸附态最低。COI 标记下，膜结合态平均 ASV 丰富度和 Shannon-Wiener 指数最高，溶解态最低；多数 ASVs 为状态特有，膜结合态占 50.8% 独特 ASVs，仅 8.4% 为三态共享。群落组成上，吸附态与膜结合态更相似，溶解态差异更大；溪流和湖泊样品共享门类但比例不同。
3.1.1 DNA Yield：通过三种状态提取和定量比较，发现溶解态 DNA 产量显著高于膜结合态和吸附态，吸附态显著低于膜结合态。
3.1.2 Alpha Richness and Diversity：通过 COI 的 ASV 丰富度、Shannon-Wiener 指数和 Venn 分析，得出膜结合态捕获丰富度和多样性最高，溶解态最低，且各状态存在大量独特 ASVs；ITS 仅膜结合态可成功扩增测序。
3.2 Downstream Transport of eDNA States From Headwaters to Lake Inlets：通过识别流连接样品对并计算 SUSO 距离与共享 ASV 比例，发现共享 ASV 随距离下降，且仅在膜结合态 COI 和 ITS 中显著，吸附态和溶解态无显著相关；β多样性周转主导。表明仅膜结合态有下游传输证据，吸附态可能沉降，溶解态可能降解。
3.3 Comparative Biodiversity in Stream Inlets and Lakes：通过比较溪流、入流、湖泊和出流样品，COI 吸附态丰富度无显著差异；溶解态湖泊高于溪流和入流；膜结合态溪流和入流高于湖泊和出流；ITS 膜结合态溪流高于湖泊。NMDS 和 PERMANOVA 显示溪流与入流聚类，湖泊与出流聚类，群落组成不同；入流–湖泊距离与共享丰富度仅在 COI 膜结合态呈弱负相关，且差异由周转主导。
3.4 Environmental Vector Fitting Analysis Revealed State-Specific Drivers of Community Structure：通过 NMDS 环境向量拟合，发现温度、pH 与群落组成梯度一致，总悬浮固体和电导率较弱但显著；温度向量在各排序中从溪流/入流指向湖泊/出流，膜结合态 COI 中温度解释力（R
2）最强，显示温度是群落组成变化的主要相关环境因子。
讨论部分：4.1 指出三种状态携带不同信息，膜结合态含多数独特 ASVs，植物仅在膜结合态检测；溶解态产量高但可扩增性低，可能因降解；吸附态产量低但可扩增，可能易沉降，建议沉积物采样；方法偏差和交叉污染可能影响。4.2 膜结合态传输呈距离衰减，其他状态证据少；溪流长度限制，高流量河流传输更远。4.3 溪流–湖泊汇流处“传送带”似中断，湖样本群落不同，但部分序列共享，如 Gammarus fossarum 和 Dinocras cephalotes 出现在湖样中；入流密度、湖泊水动力学和采样深度可能影响。4.4 局限包括状态分选需优化、区分本地与上游困难、单样本重复、100 mL 体积、仅湖泊表层采样；建议固定源、物种占据模型、跨深度采样等。
研究结论翻译：本研究证明 eDNA 状态分选的效用，但方法需要进一步改进。独立分析各状态可改善 eDNA 数据的解释，并阐明控制 eDNA 归趋和传输的过程。
