绿原酸通过抑制cGAS–STING信号通路减轻创伤性脑损伤诱导的神经炎症

《Neurotherapeutics》：Chlorogenic acid attenuates TBI-induced neuroinflammation by suppressing cGAS–STING signaling

　　

摘要专业翻译 创伤性脑损伤（TBI）可诱导持续性神经炎症，进而促成继发性脑损伤和神经功能障碍。环状GMP-AMP合酶–干扰素基因刺激因子（cGAS–STING）通路是创伤后固有免疫反应的关键调控因子。尽管绿原酸（CGA）具有公认的抗炎特性，但其在TBI后发挥保护作用的具体机制尚未完全阐明。研究人员采用小鼠控制性皮质撞击模型评估CGA的疗效，并结合批量及单细胞RNA测序、网络药理学和小鼠特异性分子对接模拟以筛选候选通路。随后，研究人员在体内实验及脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞中，利用STING激动剂DMXAA进一步探究其潜在机制。CGA治疗显著改善了TBI后的神经功能，增强了认知表现，并减轻了血脑屏障破坏。整合分析提示cGAS–STING信号通路是与CGA作用相关的候选通路，单细胞转录组分析显示该通路活性在小胶质细胞和浸润性髓系细胞群中相对较高。在机制层面，CGA在体内降低了cGAS表达，抑制了STING、TBK1和IRF3的磷酸化，并减少了促炎细胞因子的产生。在体外实验中，CGA以浓度依赖性方式降低了炎症及干扰素刺激基因的表达，并减少了活性氧（ROS）的积累；上述效应可被DMXAA大部分逆转。CGA可减轻TBI后的神经炎症反应并改善神经功能结局，其对cGAS–STING信号通路的早期抑制可能参与了这些保护效应。上述发现支持将cGAS–STING信号通路作为TBI潜在治疗靶点开展进一步研究。

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一、研究背景与目的

创伤性脑损伤（TBI）因其高致死率和幸存者长期神经功能缺损而构成沉重的全球健康负担。初始机械损伤虽难以逆转，但损伤后的继发性病理过程——尤其是持续性神经炎症——与脑水肿、血脑屏障（BBB）破坏、神经元丢失及进行性神经功能障碍密切相关。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞，在损伤后迅速响应并调控创伤后炎症微环境，但其持续活化可维持过度的炎症介质和活性氧（ROS）产生，反而放大继发性脑损伤。因此，恢复小胶质细胞免疫稳态成为TBI疾病修饰治疗的重要方向。

环状GMP-AMP合酶–干扰素基因刺激因子（cGAS–STING）通路是固有免疫系统的关键组成部分，将胞质DNA感知与炎症信号相连接。创伤后线粒体功能障碍、核损伤和细胞应激促使异常双链DNA在胞质内积累，激活cGAS–STING级联信号，进而通过TBK1和IRF3启动下游信号，促进I型干扰素及其他炎症介质产生，参与继发性组织损伤。越来越多的证据表明该通路的过度激活参与多种CNS疾病的进展，药理学抑制cGAS–STING信号可减轻神经炎症并改善神经功能恢复。

绿原酸（CGA）是一种植物来源的多酚类化合物，具有公认的抗炎和抗氧化特性。尽管CGA在多种神经系统疾病中显示出有益作用，但其在TBI后发挥保护作用的分子机制尚未明确。本研究假设抑制小胶质细胞cGAS–STING信号通路参与了CGA在TBI后的抗炎效应，并通过体内外实验、转录组分析、网络药理学、分子对接及单细胞转录组分析加以验证。

二、主要技术方法

研究人员采用雄性C57BL/6小鼠建立控制性皮质撞击（CCI）TBI模型，通过尾静脉给予低剂量（50 mg/kg）或高剂量（150 mg/kg）CGA。研究整合了批量RNA测序（DESeq2差异表达分析）、公共单细胞RNA测序数据集（GEO编号GSE302863，包含假手术及TBI后1、3、7、14天皮质样本）、网络药理学（OMIM、GeneCards、SwissTargetPrediction、TCMSP等数据库）、分子对接模拟（AutoDock Vina，基于小鼠来源蛋白结构）、细胞热位移分析（CETSA）、免疫荧光共定位、Western blot、ELISA及qRT-PCR等多种技术手段，并在LPS刺激的BV2小胶质细胞中开展机制验证和STING激动剂DMXAA的挽救实验。

三、研究结果

CGA改善TBI后神经功能恢复并保护血脑屏障完整性

通过神经功能严重程度评分（NSS）、平衡木实验、转棒实验、旷场实验和Morris水迷宫等行为学评估，高剂量CGA显著降低了TBI小鼠的NSS评分，缩短了平衡木穿越时间，延长了转棒潜伏期和距离，改善了焦虑样行为，并显著提高了水迷宫目标象限停留时间和缩短了到达目标位置的时间。伊文思蓝（EB）外渗实验显示高剂量CGA显著减少了损伤脑组织的EB渗漏，Western blot证实CGA恢复了紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，表明BBB完整性得到改善。

转录组与网络分析鉴定cGAS–STING信号为CGA作用的候选通路

研究人员将CGA相关靶点、TBI相关基因和差异表达基因（DEGs）取交集，获得103个重叠候选基因。KEGG富集分析显示炎症相关信号通路显著富集。通过五种拓扑算法（MCC、DMNC、Degree、BottleNeck、EPC）鉴定出9个共识枢纽基因，功能富集分析显示其与固有免疫和炎症信号密切相关，其中cGAS–STING信号通路在KEGG和GO分析中均显著富集。时间序列转录组分析显示cGAS–STING通路相关基因在TBI后渐进性激活，于伤后3天达到峰值。基因集富集分析（GSEA）证实TBI后Toll样受体信号、NOD样受体信号和胞质DNA感知通路均被激活。

分子对接与CETSA评估CGA与cGAS–STING通路蛋白的潜在相互作用

分子对接结果显示CGA与STING的预测结合能最优（?8.76 kcal/mol），其次为cGAS（?8.372 kcal/mol）、TBK1（?8.178 kcal/mol）和IRF3（?6.651 kcal/mol）。CETSA实验显示CGA处理显著改变了cGAS和STING的热稳定性，而TBK1和IRF3未检测到显著热位移，提示cGAS和STING是CGA作用的候选蛋白靶点。

单细胞转录组分析揭示TBI后cGAS–STING活性的细胞类型特异性分布

通过分析公共单细胞RNA测序数据集，研究人员将细胞注释为11个主要神经、免疫和血管/基质细胞群。AUCell通路活性评分显示小胶质细胞和巨噬细胞中cGAS–STING通路活性评分相对较高，且损伤后呈现动态变化。免疫荧光共定位分析显示cGAS、p-STING和p-IRF3信号在IBA-1阳性细胞中表达，CGA治疗显著降低了这些信号强度。

CGA在体内抑制TBI诱导的cGAS–STING激活

LC–MS/MS检测证实静脉注射的CGA可进入脑组织，且损伤同侧半球浓度显著高于对侧半球。Western blot显示TBI增加了cGAS表达并增强了STING、TBK1和IRF3的磷酸化，CGA治疗显著降低了cGAS表达及上述蛋白的磷酸化水平。ELISA检测显示CGA显著降低了TBI诱导的IL-1β和IL-6水平升高。

CGA减轻LPS刺激小胶质细胞的炎症反应和氧化应激

在LPS刺激的BV2小胶质细胞中，CGA以浓度依赖性方式降低了Il1b、Il6、Tnf、Cox2和Nos2的mRNA表达，并显著减少了ROS积累，且未显示细胞毒性。

CGA抑制LPS刺激小胶质细胞中cGAS–STING相关信号

CGA显著降低了LPS诱导的干扰素刺激基因（ISGs）表达，包括Isg15、Isg20、Ifit1、Ifnb1和Cxcl10，并降低了cGAS表达及STING、TBK1、IRF3的磷酸化水平。

STING激活逆转CGA对小胶质细胞炎症的抑制作用

在挽救实验中，STING激动剂DMXAA部分逆转了CGA对炎症和干扰素反应基因表达的抑制作用，并恢复了STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平。值得注意的是，LPS+CGA+DMXAA组与LPS+DMXAA组的p-STING/STING、p-TBK1/TBK1和p-IRF3/IRF3比值无显著差异，提示CGA作用于STING或其上游，而非直接抑制下游TBK1或IRF3激活。

四、讨论与结论

本研究通过整合转录组学、计算生物学和实验验证等多种互补手段，揭示了CGA在TBI后发挥抗炎作用的潜在机制。研究结果表明，抑制小胶质细胞cGAS–STING信号通路可能参与了CGA的抗炎效应。单细胞转录组分析显示TBI后小胶质细胞和浸润性巨噬细胞中cGAS–STING活性升高，但TMEM119在损伤侧皮质的表达降低提示活化小胶质细胞的标记物变化，因此不能完全排除浸润性巨噬细胞的贡献。行为学结果提示CGA的保护效应不仅限于急性期神经功能恢复，还可能影响TBI后的远期功能结局，但由于cGAS–STING活性主要在急性期评估，尚不能建立早期通路抑制与长期认知改善之间的直接因果关系。

本研究的一个优势在于采用多种分析方法相结合的策略来鉴定CGA在TBI后作用的候选分子通路，而非仅依赖药物靶点与疾病基因的直接重叠。分子对接和CETSA结果共同提示cGAS和STING是CGA作用的更可能候选蛋白靶点。

研究结论：CGA可减轻TBI后的神经炎症反应并改善神经功能结局，其对cGAS–STING信号通路的早期抑制可能参与了这些保护效应。上述发现支持将cGAS–STING信号通路作为TBI潜在治疗靶点开展进一步研究。