原白碱诱导的雌性小鼠神经毒性与血脑屏障破坏、肠道屏障损伤、胆碱能信号传导改变及肠道菌群失调有关

《NeuroToxicology》：Protopine-induced neurotoxicity in female mice is associated with blood-brain barrier disruption, gut barrier impairment, cholinergic signaling alterations and gut microbiota dysbiosis

　　

•原阿片碱诱导雌性小鼠神经行为学损害
•原阿片碱破坏血脑屏障和结肠屏障的完整性
•各组织中的胆碱能标志物及乙酰胆碱酯酶（AChE）活性发生改变
•原阿片碱暴露诱导氧化应激相关改变
•肠道菌群失调伴随原阿片碱神经毒性

引言
全球范围内减少动物生产中抗生素使用的努力，加强了对非抗生素饲料策略的探索，包括益生菌、益生元、合生元、有机酸、酶制剂、抗菌肽、噬菌体以及植源性制剂（Gadde 等，2017）。这一转变不仅受到法规压力的推动，也源于全球范围内抗菌耐药性问题所构成的巨大负担，它已成为人类和动物健康面临的最严重威胁之一（Antimicrobial Resistance Collaborators，2022）。在欧盟，饲料添加剂须经安全性和有效性评估后，方可被批准用于特定靶动物和使用条件下；安全评估涵盖靶动物、消费者、使用者/工人以及环境（欧洲议会与理事会，2003）。然而，用植物源性产品替代抗生素并不意味着生物安全性得到自动保障。此前涉及天然生物碱的担忧——包括植物性食物中的吡咯里西丁生物碱以及羽扇豆及其衍生产品中的奎诺里西丁生物碱——均表明植物来源本身并不能保证安全性（EFSA CONTAM Panel，2017、2019）。许多药用植物含有具有药理活性的生物碱，在适当剂量下可能改善生长性能或疾病抵抗力，但一旦暴露水平超过宿主的耐受范围，则可能导致器官损伤、神经毒性或屏障功能障碍。因此，植源性饲料添加剂的安全性评估应超越一般性毒性筛查，充分考虑单个活性成分、现实的暴露安全余量以及相互关联的生理系统。

角蒿 Macleaya cordata (Willd.) R. Br. 是一种富含异喹啉类生物碱的药用植物，已作为植源性饲料添加剂用于动物生产。标准化角蒿制剂被认为可以作为抗生素替代物，因为其抗菌和抗炎特性可能有助于肠道健康和生产性能；欧洲食品安全局（EFSA）的一项评估发现，以 45 mg/kg 全价饲料添加角蒿基添加剂，对改善肉鸡生长性能具有潜在有效性（EFSA FEEDAP Panel，2023）。既往研究已对角蒿属植物的植物化学、药理学和毒理学进行了总结，显示其生物效应主要归因于血根碱、异血根碱和原阿片碱等生物碱成分（Lin 等，2018）。此外，角蒿提取物还就其对抗菌耐药基因传播的影响作为抗生素替代物进行了评估（Zhang 等，2021）。目前的法规评估是针对产品、动物物种和用途的；由于这些制剂含有多种活性生物碱，针对成分的特异性毒理学研究对于确定组成规格和安全余量仍然至关重要。

原阿片碱（Protopine）是角蒿及其他植物性制剂中发现的主要生物碱成分之一。它存在于兽医药和人用药的植源制剂中，据报道具有多种药理活性，包括抗炎、镇痛、抗氧化、抗胆碱酯酶、神经活性和细胞毒作用（Hu 等，2021；Huang 等，2021）。这些既往用途、与饲料相关的潜在暴露以及未来可能的药理学应用，都提高了界定其安全谱系的重要性。原阿片碱广泛的活性也提示它可能与多种生物靶点相互作用，而非仅作用于单一器官系统。既往毒理学证据表明，原阿片碱暴露可损伤多种组织，在雌性小鼠中神经系统异常尤为显著（Hu 等，2021）。然而，与原阿片碱诱导的神经毒性相关的生物学过程仍未得到充分阐明。

中枢神经系统受到血脑屏障（BBB）的保护，血脑屏障是一种高度特化的界面，通过限制循环中的毒性物质、炎症介质和微生物产物进入，来维持神经系统的稳态。血脑屏障功能障碍越来越被认为对神经元损伤、突触紊乱和神经退行性过程具有重要贡献（Chen 等，2024；Sweeney 等，2018）。与此并行，肠上皮屏障可阻止管腔内的微生物及其代谢产物进入体循环。当肠道屏障完整性受损时，微生物产物和炎症信号可能到达外周组织并影响远端器官，包括大脑。

微生物-肠-脑轴为理解肠道微生物、上皮屏障、免疫应答、神经通路与脑功能之间的相互作用提供了框架。近年来的综述强调，胃肠道屏障和脑屏障并非被动的墙体，而是微生物-肠-脑轴上的主动通讯界面（Aburto and Cryan，2024）。肠道菌群可通过免疫、内分泌、代谢和神经通路影响神经炎症、胶质细胞活性、神经递质代谢和屏障完整性（Loh 等，2024；O'Riordan 等，2025）。这些进展提示，同时影响肠道和大脑的毒性物质可能诱导涉及微生物失调、肠道屏障受损、血脑屏障破坏和神经免疫失调的整合性反应。

尽管外界对来源于角蒿的饲料添加剂的兴趣日益浓厚，但现有研究大多聚焦于其促生长效果、抗菌潜力或产品层面的安全性评估。关于单个生物碱成分（特别是原阿片碱）如何影响协调一致的肠-脑生物学过程，所知甚少。尤其是，原阿片碱诱导的神经毒性是否伴随着血脑屏障破坏、肠道屏障受损、胆碱能信号紊乱以及肠道菌群重塑，目前仍不清楚。这一知识空白限制了针对成分的风险评估，因为神经毒性可能无法仅由对大脑的直接损伤来完全解释。

胆碱能系统在此背景下尤其重要。乙酰胆碱（ACh）对突触传递、运动调节和自主神经控制至关重要，而胆碱能抗炎通路将神经活动与免疫稳态联系起来（Halder and Lal，2021；Kelly 等，2022）。因此，胆碱能突触相关基因、乙酰胆碱酯酶活性以及紧密连接相关分子的紊乱，可能反映更广泛的神经免疫和肠-脑通讯障碍。然而，目前仍缺乏将原阿片碱暴露与胆碱能信号、屏障完整性及肠道菌群组成联系起来的整合性证据。

本研究旨在评估短期口服原阿片碱暴露对雌性小鼠的神经毒性效应，并刻画与之相关的脑损伤、血脑屏障完整性、肠道屏障状态、胆碱能信号及肠道菌群组成方面的改变。雌性 ICR 小鼠连续暴露于原阿片碱 7 天，随后进行行为学评估、组织病理学检查、伊文思蓝检测、脑转录组学分析、紧密连接及胆碱能突触相关标志物的定量验证、酶活性分析以及肠道微生物群的 16S rRNA 测序。我们假设，原阿片碱暴露将诱导神经行为学损害，并伴随屏障功能、胆碱能信号和肠道微生物生态的协调性改变，提示微生物-肠-脑轴相关变化可能参与了原阿片碱相关的神经毒性。

通过整合行为学、组织学、转录组学、生物化学和微生物组学分析，本研究为原阿片碱在雌性小鼠中暴露的多层次毒理学评估提供了证据。这种针对成分的危害信息可以补充产品层面的饲料添加剂评估，为组成规格、暴露限值的选择以及敏感神经毒性终点的选择提供依据。本研究并非旨在建立肠道菌群失调与神经毒性之间的直接因果关系，而是识别具有生物学内在一致性的相关关系，以改进含原阿片碱植物性制剂的安全性评估，并支持未来关于肠-脑毒性的机制研究。

正文节选
化学试剂
原阿片碱（纯度 >99%）按照既往描述的生物活性导向法从角蒿 Macleaya cordata (Willd.) R. Br. 中分离获得（Hu 等，2021）。简要地讲，将角蒿的乙醇提取物的正丁醇组分使用硅胶柱色谱法进行分离，依次用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱以获得主要毒性组分，随后采用石油醚-乙酸乙酯-三乙胺溶剂体系进一步纯化。原阿片碱暴露诱导了雌性小鼠的神经行为异常及脑组织病理学损伤

为评估原阿片碱暴露的神经毒性效应，对雌性小鼠的体重、脑相对重量、步态评分及脑组织病理学进行了检查。与对照组相比，原阿片碱处理小鼠在第 7 天的体重呈剂量依赖性下降（图 1A）。相比之下，高剂量原阿片碱组在第 5 天和第 7 天的脑相对重量显著增加（图 1B）。步态评分分析显示，在原阿片碱[暴露后运动异常变得明显]

讨论
本研究为短期原阿片碱暴露对雌性小鼠的整合性毒理学评估提供了证据。主要发现为：口服原阿片碱暴露诱导了运动异常和脑组织病理学损伤，同时伴有血脑屏障完整性受损、紧密连接及胆碱能突触相关标志物表达改变、氧化应激相关的生化改变、结肠屏障损伤以及肠道菌群失调。这些观察结果[表明……]

结论
综上所述，短期口服原阿片碱暴露诱导了雌性小鼠的神经行为学异常和脑组织病理学损伤。这些效应伴随着血脑屏障完整性破坏、紧密连接相关标志物表达改变、结肠屏障结构受损，以及胆碱能突触相关基因、蛋白质和乙酰胆碱酯酶活性的变化。原阿片碱还重塑了肠道菌群，表现为拟杆菌门增多，而[……减少]

缩写
缩写说明：血脑屏障（BBB）；微生物-肠-脑轴（MGBA）；自主神经系统（ANS）；胆碱乙酰转移酶（ChAT）；乙酰胆碱酯酶（AChE）；乙酰胆碱（ACh）；胆碱能受体（AChRs）；苏木精-伊红染色（H&E）；错误发现率（FDR）；差异表达基因（DEGs）；基因本体（GO）；京都基因与基因组百科全书（KEGG）；实时定量 PCR（RT-qPCR）；过氧化氢酶（CAT）；谷胱甘肽（GSH）；超氧化物歧化酶

利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可识别的财务利益冲突或个人关系，这些冲突或关系可能会对其研究中发现的成果产生潜在影响。

补充材料
补充材料包括从角蒿 Macleaya cordata (Willd.) R. Br. 中分离纯化原阿片碱的流程，以及证实纯化原阿片碱组分纯度的代表性 HPLC 色谱图。

未引用的参考文献
（EFSA CONTAM Panel（EFSA 食物链污染物专家组），2017；EFSA CONTAM Panel（EFSA 食物链污染物专家组），2019；Bampidis 等，2023）

资金支持
本研究得到了国家自然科学基金（32373057）、"胡杨英才"引进人才（博士）研究启动基金（TDZKBS202631）以及新疆重点科技创新平台（基地）人才招引项目（BTKJ）（XJRC-2025-BTKJ-YJ-CXPT-231）的资助。

CRediT 作者贡献声明
贾铮（Zheng Jia）：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。
盛尊来（Zunlai Sheng）：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目统筹、经费获取。
胡万君（Wanjun Hu）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理。

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

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