《Plant-Environment Interactions》：Screening of Different Pea (Pisum sativum L.) Genotypes for Osmotic Stress Resistance Using Selective in Vitro Systems
编辑推荐：
渗透胁迫严重限制了豌豆（Pisum sativum L.）的生长和产量。在逆境条件下优化豌豆生产，需要在生长早期阶段鉴定耐渗透胁迫的基因型。本研究旨在利用山梨醇诱导的渗透胁迫进行体外筛选，评估多种豌豆基因型的渗透胁迫耐受性。研究人员将供试基因型培养在添加三种山
渗透胁迫严重限制了豌豆（Pisum sativum L.）的生长和产量。在逆境条件下优化豌豆生产，需要在生长早期阶段鉴定耐渗透胁迫的基因型。本研究旨在利用山梨醇诱导的渗透胁迫进行体外筛选，评估多种豌豆基因型的渗透胁迫耐受性。研究人员将供试基因型培养在添加三种山梨醇浓度（0.0 M（对照）、0.1 M和0.2 M）的Murashige and Skoog（MS）培养基上，评价了多项关键生长参数。结果表明，渗透胁迫对敏感品种的萌发和生长产生负面影响，而耐受品种则表现出较强的适应能力。在供试基因型中，BD4142在最大胁迫水平（0.2 M山梨醇）下表现最佳，萌发率为43.33%，芽长（19.33 mm）和根长（32 mm）显著，植株鲜重最高（258.32 mg）。进一步的聚类分析将供试基因型划分为四个不同类群：高度敏感型、低渗透耐受型、中度渗透耐受型和高度渗透耐受型。BD4142和BD4209被鉴定为高度渗透耐受型，其中基于多性状选择指数（Multi-Trait Selection Index，MTSI），BD4142是最稳定的基因型。这些研究结果表明，BD4142可能是渗透胁迫条件下具有推广潜力的优良豌豆基因型。
论文解读
一、研究背景与意义
豌豆（Pisum sativum L.）是一种重要的豆科作物，在食品和饲料领域具有广泛的用途和显著的农艺优势。豌豆营养价值丰富，含有较高的可溶性和不可溶性膳食纤维、氨基酸（尤其是色氨酸和赖氨酸）、复合碳水化合物以及必需的维生素和矿物质，同时饱和脂肪、胆固醇和钠含量较低。豌豆适应性强，可在多种环境中广泛栽培，并以其耐寒性和通过与谷类作物轮作改善土壤健康的能力而著称，有助于改善病害管理、杂草防控和氮素固定。
然而，豌豆栽培日益受到各种胁迫的威胁，尤其是由干旱和盐碱诱导的渗透胁迫，严重影响了豌豆的生长和产量。渗透胁迫通过干扰植物水分吸收，引发一系列生理和生化改变，从而影响植物生长。在干旱和半干旱地区，土壤盐渍化和干旱频发，渗透胁迫尤为普遍。在渗透胁迫条件下，植物表现出萌发率降低、生长受阻和生产力下降，其原因在于水势降低和离子失衡。这些条件还会加剧活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，可能超出植物抗氧化防御系统的承载能力，导致氧化损伤和胁迫诱导的细胞死亡。植物为应对渗透胁迫，已发展出复杂的信号传导途径和胁迫响应机制，其中MAPK激酶、CBL–CIPK途径和SNF1相关蛋白激酶（SnRK）2家族在渗透胁迫信号传导和激活胁迫响应途径中发挥关键作用。
传统育种方法在增强作物胁迫耐受性方面往往面临遗传多样性有限和环境因素多变等制约。相比之下，体外（in vitro）技术提供了可控的环境，可将基因型与病原体和气候波动等外部胁迫因素隔离开来。这些方法已被证明在研究干旱、重金属和盐度等多种非生物胁迫响应方面卓有成效。具体而言，利用山梨醇诱导的渗透胁迫进行体外筛选，可在受控条件下精确评估种子萌发、生长和发育。此外，通过愈伤组织形成的间接再生途径为评估基因型适应性和促进遗传转化提供了有效且稳定的平台。
因此，本研究旨在利用体外筛选方法，通过评估豌豆基因型在山梨醇诱导胁迫下的萌发和生长响应，评估其渗透胁迫耐受性。主要目标是在生长早期阶段鉴定高度耐受的基因型，以增强育种计划并为培育抗逆豌豆品种作出贡献。
二、研究设计与方法
研究人员选取了10个商业化栽培的豌豆品种，这些品种基于其在全国范围内的广泛种植情况（包括干旱和盐碱影响地区）而选定，品种来源涵盖地方品种、孟加拉国农业研究所（BARI）审定品种、PGRC（植物遗传资源中心）材料以及来自尼泊尔的品种。实验在孟加拉国Patuakhali科技大学（Patuakhali Science and Technology University）生物技术实验室进行，采用完全随机设计（Completely Randomized Design，CRD），设置四次重复，并进行了两次独立实验。
研究采用的主要关键技术方法包括：种子表面消毒后接种于Murashige and Skoog（MS）基础培养基，培养基中添加三种浓度的山梨醇（0.0 M、0.1 M和0.2 M）以诱导渗透胁迫；从无菌培养的幼苗上切取包含上胚轴和下胚轴区域的外植体，转移至添加6-苄氨基嘌呤（BAP）和萘乙酸（NAA）的愈伤组织诱导培养基；将愈伤组织转移至添加BAP和NAA的芽再生培养基；将再生芽转移至含吲哚-3-乙酸（IAA）和吲哚-3-丁酸（IBA）的培养基进行根诱导。各阶段培养基均包含不同浓度的山梨醇以评估渗透胁迫的影响。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）检验基因型和胁迫水平对测定性状的影响，使用Tukey诚实显著性差异（HSD）检验在5%显著水平下比较均值差异，并利用热图聚类分析和多性状选择指数（Multi-Trait Selection Index，MTSI）鉴定性状模式和表现优良的品种。所有统计分析和图形可视化均使用R软件（v4.5.3）完成。
三、研究结果
3.1 种子萌发率
山梨醇诱导的渗透胁迫对供试豌豆基因型的萌发率有极显著影响（p ≤ 0.001）。随着山梨醇浓度的增加，萌发率明显下降。在对照条件（0.0 M山梨醇）下，各品种间无显著差异。在0.1 M山梨醇条件下，BD4142的萌发率最高，达63.33%，其次是BARI Motor 1和BD4209（56.67%），Sikkim Local表现最低（26.67%）。在最大胁迫（0.2 M山梨醇）下，所有基因型萌发率均下降，BD4142仍以43.33%的萌发率居首，BD4209以40%次之，Sikkim Local最低（16.67%）。
3.2 愈伤组织形成
愈伤组织形成在不同山梨醇浓度间表现出显著差异（p ≤ 0.001）。对照条件下平均愈伤组织形成率最高，在0.1 M和0.2 M浓度下明显下降。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的愈伤组织形成率最高（26.67%），BD4209次之（23.33%），而Sikkim Local、IPSA Motor 3和BARI Motor 3未能形成任何愈伤组织。
3.3 愈伤组织大小
山梨醇浓度对愈伤组织大小有显著影响（p ≤ 0.001）。随着山梨醇浓度从0.0 M增加到0.2 M，所有基因型的愈伤组织大小均明显减小。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的愈伤组织最大（15 mm2），BD9047最小（4.63 mm2）。
3.4 芽形成
山梨醇浓度显著影响芽形成（p ≤ 0.001）。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的芽形成率最高（30%），而Sikkim Local、IPSA Motor 3、BARI Motor 3、Faridpur Local和BD9047均未能形成芽。
3.5 芽长
芽长在不同山梨醇浓度间差异显著（p ≤ 0.001）。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的芽最长（19.33 mm），Bagha Local最短（9.50 mm）。
3.6 根形成
根形成率受山梨醇浓度显著影响（p ≤ 0.001）。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的根形成率最高（23.33%），而Sikkim Local、IPSA Motor 3、BARI Motor 3、Faridpur Local和BD9047均未能形成根。
3.7 最长根长度
根长在不同山梨醇浓度间表现出显著差异（p ≤ 0.001）。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的根最长（32.67 mm），Bagha Local最短（18.50 mm）。
3.8 植株鲜重
植株鲜重在不同山梨醇浓度间差异显著（p ≤ 0.001）。在0.2 M山梨醇条件下，BD4142的鲜重最高（258.32 mg），BD4209次之（201.72 mg），而BARI Motor 3、BD9047、Faridpur Local、IPSA Motor 3和Sikkim Local未能产生任何可测量的植株部分。
3.9 双因素方差分析
双因素方差分析表明，培养基中山梨醇浓度对所有测定性状的影响最为显著，其次是基因型以及基因型与山梨醇浓度的交互作用。
3.10 热图聚类分析
聚类分析基于所有测定性状将基因型分为四个不同类群：第一类群为BD4142和BD4209，属于耐受型；第二类群包括BD4181、BARI Motor 1和Bagha Local，属于中度耐受型；第三类群为Sikkim Local，属于高度敏感型；第四类群包括IPSA Motor 3、BARI Motor 3、Faridpur Local和BD9047，属于低渗透耐受型。
3.11 多性状选择指数（MTSI）
MTSI分析根据期望性状值评价豌豆基因型，BD4142和BD4209被鉴定为最稳定的基因型。
四、讨论与结论
讨论部分指出，萌发是植物生命周期中的关键阶段，对环境胁迫高度敏感。本研究中山梨醇浓度增加导致萌发率下降，与已有研究报道的渗透胁迫下萌发率降低的趋势一致。BD4142和BD4209在胁迫下表现出较高的萌发率，表明这些基因型具有较高的渗透胁迫耐受性。愈伤组织形成方面，山梨醇作为渗透剂通过降低水势抑制愈伤组织生长，BD4142在较高山梨醇浓度下仍表现出优越的愈伤组织形成能力。在植物发育方面，山梨醇诱导的渗透胁迫导致所有基因型的芽形成、根形成、芽长、根长和植株鲜重显著降低，这与降低水势和抑制水分吸收有关。BD4142和BD4209在芽和根形成方面表现优越，表明这些基因型具有适应渗透胁迫的机制，如增强根系生长以改善水分吸收。植株鲜重下降可能与山梨醇水平升高破坏细胞分裂、细胞质体积、膨压维持和养分平衡有关。聚类分析和MTSI分析进一步证实了基因型间的差异响应，BD4142和BD4209为最耐受基因型，Sikkim Local为高度敏感型。
研究结论指出，该研究成功鉴定并分类了不同豌豆基因型对山梨醇诱导渗透胁迫的抗性。随着山梨醇浓度增加，萌发、愈伤组织形成以及芽长、根长和植株鲜重等生长指标均显著下降。值得注意的是，BD4142是最具适应性的基因型，在最大山梨醇浓度下表现出最高的萌发率和生长量，而Sikkim Local是最敏感的基因型。研究人员建议结合这些基因型的生化和生理响应开展进一步的田间试验，以确认其作为耐渗透胁迫豌豆品种的适宜性。
