大黄素通过抑制 TFAP2A/MMP9 轴抑制胰腺癌进展和糖酵解：一项整合生物信息学与实验研究

《Pathology - Research and Practice》：Rhein suppresses pancreatic cancer progression and glycolysis by inhibiting the TFAP2A/MMP9 axis: An integrated bioinformatics and experimental study

摘要

背景

胰腺癌仍是一种致死率极高的恶性肿瘤，治疗手段十分有限。大黄素是一种天然蒽醌类化合物，具有抗肿瘤潜力，但其靶向胰腺癌的具体分子靶点仍知之甚少。本研究旨在阐明大黄素在胰腺癌中的作用机制。

方法

利用GSE101448数据集进行生物信息学分析并结合机器学习，筛选出基质金属蛋白酶9（MMP9）作为大黄素与胰腺癌的核心基因。采用Western blot检测MMP9和转录因子AP-2α（TFAP2A）的蛋白水平。分别采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、集落形成实验和划痕实验检测细胞活力、增殖及迁移能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡。利用相应检测试剂盒测量乳酸产量、葡萄糖消耗量和腺苷三磷酸（ATP）水平。通过JASPAR预测TFAP2A与MMP9启动子之间的结合，并采用染色质免疫共沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验进行验证。通过分子对接研究大黄素与TFAP2A之间的相互作用。在异种移植模型中探讨大黄素对肿瘤生长的影响。

结果

在大黄素处理的胰腺癌细胞中，MMP9表达受到抑制（P < 0.05）。大黄素处理促进细胞凋亡，抑制集落形成、迁移和糖酵解，而MMP9过表达可逆转上述作用（所有P < 0.05）。此外，在大鼠模型中，MMP9过表达削弱了大黄素对肿瘤生长的抑制作用。机制上，大黄素通过抑制TFAP2A下调MMP9的转录。大黄素通过抑制TFAP2A/MMP9轴发挥抗肿瘤作用。TFAP2A过表达抑制了大黄素处理后细胞的凋亡，并促进其迁移和糖酵解，而在MMP9敲低后上述效应被显著消除（所有P < 0.05）。

结论

大黄素通过抑制TFAP2A/MMP9轴发挥抗肿瘤作用，为胰腺癌提供了一种具有前景的治疗药物。

引言

胰腺癌是全球致死率最高的肿瘤之一。其五年生存率低至约13% [1], [2], [3]。由于其发病隐匿、缺乏可靠的早期诊断生物标志物以及早期侵袭和转移的强烈倾向，超过80%的患者在确诊时已处于晚期或转移阶段，无法进行根治性手术 [4], [5], [6]。目前晚期胰腺癌的标准治疗方案包括化疗、针对特定分子亚组的有限靶向药物（例如，针对乳腺癌易感基因（BRCA）突变的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂、克氏鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）G12C抑制剂），以及针对微卫星不稳定性高/错配修复缺陷（MSI-H/dMMR）肿瘤的免疫治疗 [7], [8], [9], [10], [11]。然而，由于疗效有限、耐药性迅速产生以及严重的全身毒性，治疗效果受到制约 [12]。因此，鉴定新的治疗药物并阐明其分子机制对于改善患者预后至关重要。

胰腺癌具有独特的代谢和分子特征，其常见的遗传改变（如KRAS、肿瘤蛋白53（TP53）、 Mothers against decapentaplegic同源物4（SMAD4）、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）等）以及致密的纤维化微环境均是其对传统治疗产生深刻耐药性的原因 [13], [14]。越来越多的胰腺癌患者开始使用补充与替代医学（CAM） [15], [16]。在这些新兴策略中，中药活性成分展现出推动治疗进步的潜力 [17], [18], [19]。大黄素是一种主要源自大黄（Rheum palmatum）的蒽醌类化合物，具有多种药理学活性，包括抗炎和抗肿瘤作用 [20], [21], [22], [23]。此前研究表明，大黄素通过活性氧（ROS）介导的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）失活，诱导胰腺癌细胞发生线粒体凋亡 [24]。此外，大黄素在某些肿瘤模型中也被证实可抑制糖酵解 [25], [26], [27]。同时，大黄素通过抑制信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号通路，增强胰腺癌细胞对表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂（厄洛替尼）的敏感性 [19]。然而，大黄素中涉及转录调控因子和代谢效应因子的具体机制尚未被完全阐明。

基质金属蛋白酶9（MMP9）属于基质金属蛋白酶家族 [28]。MMP9在包括胰腺癌在内的多种肿瘤中表达上调 [29]。此前研究表明，糖酵解过程中乳酸的积累可能参与pH变化，从而刺激组织蛋白酶和MMP9的活化 [30]。MMP9可通过修饰细胞外基质（ECM）促进肿瘤侵袭和转移 [31]。已有研究显示大黄素可抑制胰腺癌细胞中的MMP9 [24]，其对MMP9的作用仍有待实验验证。转录因子AP-2α（TFAP2A）是AP-2转录因子家族的一员，参与调控细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤进展 [32]。TFAP2A通过与启动子特定序列结合调控下游靶基因的表达 [33]。其异常表达与多种肿瘤的发生、代谢及进展密切相关 [33], [34], [35], [36], [37]。然而，TFAP2A与MMP9在胰腺癌中的调控关系，以及大黄素能否通过调控TFAP2A/MMP9轴发挥抗肿瘤作用，尚未见报道。

本研究结合生物信息学分析和实验验证，阐明大黄素在胰腺癌中抗肿瘤作用的机制。结果表明，大黄素通过抑制TFAP2A/MMP9轴抑制胰腺癌的进展，为将大黄素作为胰腺癌治疗药物提供了新的研究思路。

章节片段

差异表达基因筛选

从基因表达综合数据库（GEO）下载包含24份胰腺癌组织和19份非肿瘤胰腺组织的GEO数据集GSE101448（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)）。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为|log?倍数变化（FC）| > 1.0且校正P值 < 0.05。

功能富集分析

采用"clusterProfiler"包进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。排名前五的

分子对接

从PubChem获取大黄素的结构（CID: 10168）。从蛋白质数据银行获取TFAP2A的DNA结合域（PDB: 8J0L）。使用AutoDock Vina软件进行分子对接。使用PyMOL和Discovery Studio Visualizer分析结合亲和力及相互作用模式。

差异表达基因鉴定

为筛选参与胰腺癌进展的关键基因，对包含24份胰腺癌组织和19份非肿瘤胰腺组织的GSE101448数据集进行分析。以|logFC| > 1.0且校正P < 0.05为标准，共鉴定出2121个差异表达基因，其中包括1152个上调基因和969个下调基因（图1A）。所有差异表达基因的热图显示，胰腺癌组织与非肿瘤胰腺组织之间存在显著的基因表达差异（图1B）。该

讨论

胰腺癌是一种侵袭性极强、预后极差的恶性肿瘤，亟需开发新型抗肿瘤治疗药物并阐明其作用机制 [3]。大黄素是一种源自中药的天然化合物，具有抗肿瘤特性，对多种癌症可能具有潜在的治疗作用 [21]，但其在胰腺癌中的具体机制仍不明确。本研究结合生物信息学分析与实验验证，探讨了大黄素在胰腺癌中的调控机制，结果发现

结论

综上所述，本研究整合了生物信息学、机器学习以及体外和体内实验，发现大黄素通过抑制TFAP2A/MMP9轴促进细胞凋亡、抑制迁移和糖酵解。该结果为将大黄素重新定位为胰腺癌的潜在治疗药物提供了分子依据。

图S1 MMP9敲低对肿瘤细胞的单独影响。 将CFPAC-1或SW1990细胞转染sh-NC或sh-MMP9。（A）MMP9表达

伦理批准与参与同意

所有小鼠实验均经重庆高新区第一人民医院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：202501）。动物实验严格遵循ARRIVE指南和3Rs原则。

资金支持

无资金支持可报告。

作者贡献声明（CRediT）

杨盈盈：撰写—初稿，监督指导，项目管理，调查研究。陈杰：验证，资源，正式分析。刘鑫：撰写—审阅与编辑，可视化，概念化。肖蜀萍：数据整理。杜晓燕：软件，方法论。

利益冲突声明

作者声明，不存在任何已知的可能影响本文研究工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

无

利益冲突

作者声明无利益冲突。

杨盈盈|陈杰|肖蜀萍|杜晓燕|刘鑫