《Pharmacological Research》：Nε-(Carboxymethyl)lysine induces mitochondrial stress, inflammatory activation, and fibrogenic remodelling in multicellular human liver organoids
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Nε-(Carboxymethyl)lysine (CML)在多细胞人肝类器官(human liver organoids, HLOs)中诱导线粒体应激(mitochondrial stress)、炎症激活(inflammatory ac
Nε-(Carboxymethyl)lysine (CML)在多细胞人肝类器官(human liver organoids, HLOs)中诱导线粒体应激(mitochondrial stress)、炎症激活(inflammatory activation)与纤维化重塑(fibrogenic remodelling)。肝CML在人类脂肪性肝病(steatotic liver disease)中升高。CML在肝脏模型中激活AGE–RAGE(advanced glycation end-product–receptor for advanced glycation end-products，晚期糖基化终产物–晚期糖基化终产物受体信号)及TGF-β(transforming growth factor-β，转化生长因子β)相关通路。人肝类器官显示CML诱导的脂质(lipid)与纤维化(fibrogenic)重塑。
该研究围绕N
ε-(Carboxymethyl)lysine (CML)在代谢性肝病中的作用展开。AGEs(advanced glycation end-products，晚期糖基化终产物)是化学异质基团，不同AGE物种在来源、分子形式、组织分布、受体相互作用和生物学活性上不同，因此将AGEs视为单一实体可能掩盖物种特异性致病效应。AGE–RAGE(advanced glycation end-product–receptor for advanced glycation end-products，晚期糖基化终产物–晚期糖基化终产物受体信号)参与氧化应激、炎症和组织重塑，并与慢性肝病相关。CML是组织蛋白上常见且研究较多的AGE加合物，可由糖氧化和脂质过氧化生成，并可参与RAGE、NF-κB(nuclear factor kappa B，核因子κB)相关信号和炎症基因表达调控。已有研究提示人脂肪肝中内源性CML形成增加，慢性肝病和肝硬化中CML修饰AGEs升高，动物研究显示游离CML或膳食CML可改变代谢参数、加重肝脂肪变性，并涉及CML–RAGE信号。但仍有问题未明：局部肝CML负担是否可由循环CML或总AGE反映尚不清楚；小鼠模型与人脂肪性肝病转录组一致性有限；HepG2系统在分化肝功能与代谢方面有局限。因此，研究人员提出CML可诱导以肝细胞样细胞线粒体应激、炎症激活和星状细胞相关纤维化重塑为特征的多细胞肝脏反应，并在多细胞人肝类器官中检验。该研究发表在《Pharmacological Research》，其意义在于区分肝CML与总AGE及循环CML，定义CML相关表型的模型依赖性，并在人多细胞肝模型中识别协调的线粒体、免疫相关和纤维化反应及其药理可调性。
关键技术方法：研究人员使用公共肝转录组队列GSE126848、GSE48452、GSE89632进行ssGSEA(single-sample gene set enrichment analysis，单样本基因集富集分析)；检测人肝组织和血清总AGE与CML；使用C57BL/6J小鼠口服CML 10或20 mg/kg 12周，并设高脂饮食对照；使用HepG2 2D/3D及原代小鼠肝细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞；由hiPSCs(human induced pluripotent stem cells，人诱导多能干细胞)生成HEOs(hepatic endoderm organoids，肝内胚层类器官)并成熟为HLOs；采用bulk和单细胞RNA测序、qRT-PCR、免疫荧光、组织学、RNAscope、ELISA、脂质染色、甘油三酯测定、细胞因子阵列、蛋白质组学、Seahorse XF、LDH释放、视黄醇储存和抑制剂实验。人血清来自正常6例和脂肪变性6例，肝组织来自正常3例和脂肪变性3例。
研究结果：
3.1 AGE–RAGE通路活性与脂肪性肝炎相关特征相关，肝CML在脂肪变性肝中升高。研究人员在三个独立公共肝转录组队列中计算AGE–RAGE通路ssGSEA评分，发现其在NAFL、NASH、明确NASH、小叶炎症和纤维化严重度相关分组中较高，但并非所有肥胖、脂肪变性或临界NASH比较均升高；人肝组织和血清总AGE在正常与脂肪变性间无显著差异，而肝CML在脂肪变性中升高，血清CML无显著差异。结论是AGE–RAGE通路活性与脂肪性肝炎相关特征相关，肝CML选择性升高，但该人数据不确立CML为上游驱动因素。
3.2 口服CML诱导肝分子反应但无明显纤维化，而HepG2模型显示有限CML诱导脂质积累。小鼠口服CML后肝CML免疫反应性增加，但H&E形态改变有限，Sirius Red未见明显胶原沉积；20 mg/kg CML小鼠肝转录组出现差异表达基因，富集AGE–RAGE、TGF-β、脂质与动脉粥样硬化、细胞黏附等通路，RNAscope显示TGF-β RNA信号随剂量增加；原代小鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞在0–3 μM CML范围内维持活力；HepG2 2D/3D对OA(oleic acid，油酸)产生明显脂质积累，而CML相关脂质积累有限。结论为口服CML可诱导肝分子变化但未在测试期形成明显纤维化，HepG2模型不能完全重现CML相关脂质表型。
3.3 HLO多细胞肝身份和功能表征。研究人员由hiPSCs经定形内胚层、前肠、HEO和肝成熟阶段生成HLOs，HEOs可扩增、冻存和恢复；分化过程中CK19、AFP、ALB、HNF4A、HNF1B、CDX2等谱系相关基因表达逐步变化；免疫荧光显示ALB、AAT、CK19、SOX9、ZO-1、F-actin、vimentin等表达与空间组织；蛋白质组学和单细胞RNA测序显示肝细胞样、胆管细胞样、星状细胞样和Kupffer样群体相关标志；HLOs较HEOs分泌更多载脂蛋白B和 albumin，并具更高CYP3A4活性。结论为第27天HLOs可作为成熟多细胞肝模型。
3.4 CML诱导剂量和时间相关脂质积累，并在HLO中形成不同于OA的转录状态。CML从100 μM起增加BODIPY荧光，250和500 μM更强；250 μM CML在24 h未显著增加LDH释放，500 μM增加；250 μM CML脂质积累随时间至第15天增加，Oil Red O、H&E、AAT降低和甘油三酯增加支持脂质蓄积，但OA诱导更强；CEL、MG-H1、MGO未产生同等BODIPY模式，抗RAGE抗体减弱CML相关BODIPY增加；bulk RNA测序将对照、CML和OA处理HLOs区分开。结论为CML诱导可重复的脂质积累，并与OA诱导的全局转录状态不同。
3.5 单细胞分析识别CML暴露后回收细胞组成变化和候选细胞类型相关程序。单细胞RNA测序在对照和CML处理HLOs中识别肝细胞样、Kupffer细胞样、星状细胞样和胆管细胞样簇；回收细胞总体分布显著不同，肝细胞样比例由63.0%降至34.0%，Kupffer样由10.8%升至33.9%，星状样由17.7%升至25.6%，胆管样由8.5%变为6.3%；肝细胞样簇差异基因富集线粒体内膜、电子传递、呼吸体、ATP合成、缺氧反应和细胞呼吸；Kupffer样簇富集脂肪酸代谢、长链脂肪酸转运、受体结合和细胞表面相关项；全局CML vs 对照有103个差异基因，富集IL-10信号、胶原纤维组装与降解、胰岛素加工和离子通道等；推断活跃态星状细胞样比例升高。结论为CML处理后出现细胞类型相关的线粒体、脂质处理、炎症和基质重塑程序，但回收分析不能直接解释真实类器官内丰度，也不确立时序或方向性级联。
3.6 功能测定显示情境依赖性肝细胞损伤及并发生物能量、炎症和纤维化反应。原代小鼠肝细胞中CML单独引起LDH释放有限，但在OA共暴露下高浓度CML增加LDH释放；MitoSOX变化有限，JC-1比值在OA共暴露高浓度CML增加，提示线粒体膜电位相关信号改变而非去极化。HLOs暴露250 μM CML 2 h后OCR(oxygen consumption rate，氧消耗率)增加，基础呼吸、质子漏、ATP相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力升高，并改变G6PC1、SLC2A1、PCK1、PDK4、FXR、EPCAM、BAAT、SLC27A5、SREBF1、APOA4等代谢和肝功能基因表达；细胞因子阵列显示DAMP、炎症和纤维化相关介质信号改变，通路分析涉及NF-κB和肝纤维化信号；TNF-α分泌和IL6 mRNA增加；COL1A1、ACTA2、LRP1、PDGFRB转录增加；视黄醇储存降低；Masson三色染色胶原阳性面积增加；CML对若干星状细胞活化转录本的作用强于CEL或MG-H1。结论为CML在HLOs中诱导协调的生物能量、炎症和纤维化重塑，但未解析各介质细胞来源或建立免疫细胞介导星状细胞活化的因果序列。
3.7 患者生物样本显示与CML处理HLO中炎症和组织重塑特征部分一致。研究人员分析12例参与者血清细胞因子谱（正常6例、脂肪变性6例）和6例肝组织蛋白质组（正常3例、脂肪变性3例）；展示的血清细胞因子阵列采用每组一个代表性标本半定量比较，显示DAMP、炎症和纤维化相关介质信号有高有低；肝组织蛋白质组在脂肪变性中鉴定425个丰度升高和95个降低蛋白，富集IL-6–JAK–STAT3信号、炎症反应、顶端连接和p53相关通路。结论为患者来源数据与CML处理HLOs中的炎症和组织重塑主题部分一致，支持转化相关性，但属于部分主题一致性而非临床验证。
3.8 药理扰动减弱选定CML相关表型。NAC(N-acetylcysteine，N-乙酰半胱氨酸)、clodronate或2DG(2-deoxy-D-glucose，2-脱氧-D-葡萄糖)共处理降低CML相关BODIPY荧光；72 h抑制实验中CML增加LDH释放，NAC和2DG降低LDH释放；CML降低视黄醇荧光，NAC、clodronate或2DG相对CML增加该信号；Bay 11-7082共处理减弱CML 2 h诱导的线粒体呼吸增加，包括基础、ATP相关、最大和备用呼吸能力；计算分析预测NF-κB相关网络和线粒体相关靶基因富集。结论为CML相关HLO表型多个组分可被药理调节，涉及氧化应激、代谢活动、巨噬细胞相关过程和NF-κB相关信号，但精确细胞序列和通路方向性仍未确定。
讨论部分总结：该研究识别肝CML为与脂肪性肝相关的AGE相关特征，并显示CML在多细胞HLOs中诱导协调的代谢、炎症和纤维化反应。人肝数据集显示AGE–RAGE通路活性与脂肪变性和脂肪性肝炎特征相关，而直接生物样本测量显示肝CML升高，但总肝AGE和循环CML未同步升高，提示循环AGE不能完全替代局部肝糖化负担。模型比较显示CML反应强烈受细胞和组织背景影响：小鼠口服CML诱导分子改变但未形成明显组织学纤维化；HepG2对OA反应明显而对CML脂质积累有限；HLO基线具有多谱系标志、上皮组织和分泌代谢功能。250 μM CML应视为机制性应激范式而非临床剂量等效。机制上，CML增加线粒体呼吸需求和质子漏，伴随代谢程序改变、DAMP和细胞因子相关介质、星状细胞活化、视黄醇储存丢失和胶原沉积；抗RAGE支持RAGE相关信号参与脂质积累；CML反应强于CEL、MG-H1或MGO，但不确立唯一CML特异性受体机制。药理扰动支持氧化应激、糖依赖代谢、巨噬细胞相关活动和NF-κB相关信号参与，但不能证明线性通路或细胞特异性因果。患者血清细胞因子和肝蛋白质组显示部分重叠，但样本小且阵列半定量，不能作为CML驱动机制的临床验证。局限包括HLO缺乏血管灌注和完整内分泌、内皮、适应性免疫环境；CML处理组单细胞回收数较少，细胞比例变化可能受存活或解离/回收偏倚影响；时序和方向性未解析；暴露浓度非临床剂量当量；患者样本量和半定量设计限制推断。未来需时间分辨单细胞分析、细胞类型特异扰动、条件培养基实验、血管化或免疫更复杂HLO模型以及覆盖纤维化阶段的更大患者队列。
研究结论部分翻译：本研究将肝CML鉴定为与脂肪性肝相关的AGE相关特征，并证明多细胞HLOs中对CML的协调代谢、线粒体、炎症和纤维化反应。这些反应在小鼠和HepG2模型中仅部分重现，强调组织背景的重要性。患者来源血清和肝脏谱与CML相关HLO特征部分一致，支持该模型的转化相关性。因此，CML–HLO系统为研究AGE相关肝病理提供了有用的人多细胞平台，尽管起始细胞类型、信号方向性和临床暴露等效性仍有待确定。
