百合AP2/ERF转录因子家族全基因组鉴定及LhERF061负调控切花衰老的功能解析

《Postharvest Biology and Technology》：Genome-wide identification of the AP2/ERF transcription factor family in lily and the role of LhERF061 in regulating cut flower senescence

　　

在百合（Lilium）中鉴定到的AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）家族是一个包含304个成员的大基因家族。LhERF061编码一种定位于细胞核（nucleus）的亲水性蛋白（hydrophilic protein）。LhERF061在百合中作为衰老（senescence）的负调控因子（negative regulator）发挥作用。

研究背景：AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）基因超家族是植物中最大的转录因子家族之一，成员至少含一个AP2结构域，该结构域由β-折叠和几乎平行的α-螺旋构成，含60–70个高度保守氨基酸残基。根据AP2域数量和相似性，该家族分为AP2（APETALA2）、DREB（dehydration-responsive element binding proteins）、ERF（ethylene-responsive factor）、RAV（related to ABI3/VP）和Soloist亚家族。该家族已在拟南芥（147个成员）、葡萄（132）、萝卜（247）、姜（163）、花生（188）、水稻（170）、玉米（229）和大麦（121）等植物中鉴定。其成员参与植物生长发育和胁迫响应，如AtAP2调控开花时间、种子质量与大小，AtBBM促进体细胞胚胎发生，SlERF36负调控烟草气孔密度并导致早花早衰，CRF6延迟花瓣衰老，RhERF113负调控玫瑰花瓣衰老，OsDREB与耐旱、高盐和低温有关，AtERF1、AtERF6、AtERF104和AtERF105响应高光，AtRAV1参与ABA（abscisic acid，脱落酸）信号及干旱、盐胁迫。尽管AP2/ERF在植物中广泛研究，但其在百合花瓣衰老中的作用研究稀缺；近年转录组和功能研究揭示多个转录因子通过ABA和ROS（reactive oxygen species，活性氧）通路调控百合花瓣衰老。为此，研究人员开展百合AP2/ERF全基因组鉴定和生物信息学分析，结合花瓣衰老转录组分析表达谱，并聚焦LhERF061，通过沉默和过表达研究其对切花百合衰老的调控功能。研究得出，百合基因组含304个LhAP2/ERF成员，LhERF061为核定位亲水性蛋白，是衰老负调控因子，可延缓切花百合衰老。该研究为百合分子育种和切花保鲜提供了重要基因资源和理论依据。

技术方法：研究人员以切花百合‘Manissa’为材料，球茎购自中国云南昆明斗南花市场，种植于昆明理工大学建筑与城市规划学院温室。主要技术包括全基因组BLASTP和HMM（PF00847）鉴定并经Pfam、SMART、CDD验证；染色体定位和系统进化分析；MEME基序和PlantCARE顺式作用元件分析；RNA-seq（RNA sequencing，转录组测序）和qRT-PCR（quantitative real-time PCR，实时荧光定量PCR）；cDNA克隆和亚细胞定位；VIGS（virus-induced gene silencing，病毒诱导基因沉默）和过表达；拟南芥转化；相对含水量、相对电解质渗漏、MDA（malondialdehyde，丙二醛）和H₂O₂含量测定。样本队列来源为云南昆明斗南花市场购买的‘Manissa’球茎。

研究结果：3.1 百合LhAP2/ERF基因鉴定及染色体分布：以At5G51190.1为查询序列，结合HMM（PF00847）进行BLASTP，经Pfam、SMART、CDD验证后，鉴定304个LhAP2/ERF成员，命名为LhERF1–LhERF304。其分布在12条染色体上，LG02最多（96个），LG03次之（35个），LG05最少（7个）。氨基酸长度76–684 aa，pI 4.37–11.49，分子量8430.8–73,673.48 Da；预测191个定位于细胞核，83个叶绿体，8个胞质，15个线粒体，LhERF47在液泡，LhERF62在高尔基体，LhERF241在过氧化物酶体，LhERF118、LhERF151、LhERF222和LhERF278在胞外。3.2 系统进化分析：304个LhAP2/ERF与拟南芥AtAP2/ERF构建进化树，分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5个亚家族、17个进化支；DREB分9个亚组A1–A9，ERF分6个亚组B1–B6。DREB含199个（65.46%），ERF含81个（26.64%），AP2含11个，RAV含10个，Soloist仅3个。ERF和DREB成员各含一个AP2域，RAV含一个AP2域和一个B3域，Soloist含AP2样保守域。3.3 结构域与基序分布：304个LhAP2/ERF蛋白分为5组17亚组，同亚家族基序组成和分布高度相似。多数成员含Motif 1、Motif 2和Motif 4，为AP2域核心基序；RAV亚家族保守基序最少，仅2个；DREB多数具Motif 3，少数具Motif 6；ERF常见Motif 5。DREB、ERF、RAV各含一个AP2域，RAV另有B3域，Soloist含AP2样域。3.4 顺式作用元件：提取2000 bp上游启动子区，鉴定10657个顺式元件，分为光响应4183个（39.25%）、激素响应3414个（32.01%）、生长发育相关2072个（19.44%）、胁迫响应988个（9.27%）。激素元件包括MeJA（1641）、ABA（961）、生长素（314）、赤霉素（286）、水杨酸（212）；胁迫元件包括干旱（498）、低温（299）、缺氧（174）、创伤（17）。248个基因同时参与生长/发育、激素和非生物胁迫响应等。3.5 衰老过程表达分析：基于切花衰老转录组，72个基因随衰老持续上升，166个先升后降，53个持续下降。LhERF061早期高表达，RPKM为98.17，后降至29.15 RPKM，为衰老过程中下调最显著者。3.6 LhERF061基因克隆：以绿蕾期cDNA为模板扩增约770 bp产物，CDS为717 bp。3.7 LhERF061生物信息学分析：3.7.1 理化性质与结构预测显示，LhERF061编码238 aa，分子式C₁₁₈₆H₁₈₈₆N₃₅₂O₃₆₄S₆，3794个原子，分子量27,092.52 Da，pI 8.91，不稳定指数62.78，GRAVY为–0.687，为亲水性蛋白；α-螺旋占49.58%，延伸链10.50%，β-转角3.36%，无规卷曲36.55%，三级结构由α-螺旋和无规卷曲组成。3.7.2 氨基酸序列和序列分析显示，LhERF061与另外7种植物共享8个相似motif，Motif 1含50个氨基酸残基且高度保守。3.7.3 多序列比对显示，LhERF061与Dioscorea oppositifolia相似度最高（58.70%），其次为Elaeis guineensis（55.51%）和Zingiber officinale（54.90%），与其他植物约53%。3.8 表达特异性分析：3.8.1 时空表达分析显示，ABA处理下表达最高，低温、GABA（γ-氨基丁酸）次之，高温最低；根中中等，柱头最低；花蕾发育和衰老过程中逐渐下降。3.9 亚细胞定位：在拟南芥原生质体中，LhERF061-GFP主要在细胞核发出绿色荧光。3.10 病毒诱导瞬时沉默：3.10.1 表型显示，TRV2::LhERF061较TRV2和WT早2天衰老，第12天开始萎蔫，而对照仍新鲜。3.10.2 LhERF061与LhSAG39表达显示，LhERF061随时间下降，沉默株更低，第1、10、13天显著；LhSAG39先升后降，第10天峰值，第10、13天沉默株显著高于对照。3.10.3 相对含水量显示，第6–14天沉默株低于对照。3.10.4 相对电解质渗漏和MDA显示，二者随衰老升高；第0–8天沉默株电解质渗漏较低，第10–14天较高，第2、4、6、8、12、14天显著；第0、1天MDA较低，第4–13天高于对照约1.9倍。3.10.5 H₂O₂含量显示，沉默株持续高于对照，第1–13天显著。3.11 LhERF061过表达：3.11.1 表型显示，WT切花第12天褐变、第14天明显衰老，OE-LhERF061第14天仍新鲜；对照花瓣盘第6天明显褐变，OE第8天才褐变。3.11.2 LhERF061和LhSAG39表达显示，OE中LhERF061第1–13天高于WT，第0、1、7、10、13天分别高1.5、1.4、5.8、47和46倍；LhSAG39在WT第4–13天高于OE，第7–13天分别为3.0、2.2和1.9倍。3.11.3 相对含水量显示，第10–14天OE比WT高1.31、1.33和1.41倍。3.11.4 相对电解质渗漏和MDA显示，OE第12、14天电解质渗漏为WT的72%和70%；第1、4、7天MDA为WT的20%、30%和31%，第10、13天为58%和57%。3.11.5 H₂O₂显示，OE第4、7天为WT的53%和57%。3.11.6 拟南芥过表达显示，40天时WT叶片黄化萎蔫、角果变黄，OE-1和OE-2多数叶片未萎蔫，部分角果仍绿。3.11.7 转基因拟南芥基因表达显示，OE-1和OE-2中LhERF061比WT高1.84和1.79倍，AtSAG39仅为WT的47.4%和55.3%。

讨论部分总结：AP2/ERF是植物最大且功能多样的转录因子家族之一。百合中304个LhAP2/ERF成员远多于拟南芥147个和水稻163个，也高于兰花116个和桂花227个，接近人参318个。百合基因组中鉴定到12个串联重复基因簇，提示串联重复在该家族扩张中作用重要。系统进化将304个基因分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5个亚家族，DREB和ERF占多数，DREB/ERF比约1.66，DREB显著扩张可能与适应特定环境胁迫有关。LhERF061随切花百合衰老逐渐下降；沉默加速衰老并促进H₂O₂、MDA积累和相对电解质渗漏升高，过表达则降低这些指标。AtERF019过表达可延缓植物衰老并使MDA降低约30%；PiERF1通过减少MDA积累延迟衰老。LhERF061瞬时过表达延缓切花和花瓣盘衰老，沉默加速衰老；拟南芥异源过表达延缓衰老并抑制AtSAG39，表明其为衰老负调控因子。与LoZAT12直接激活LoSAG39促进衰老不同，LhERF061与LhSAG39降低和ROS积累缓解相关，说明不同转录因子对同一衰老标记基因可发挥相反调控。研究局限在于主要基于转录组和瞬时功能验证，尚缺直接蛋白-DNA互作证据；后续将用EMSA、Y1H、ChIP-qPCR和DLR验证LhERF061与下游靶基因的直接结合和调控关系。类似负调控还包括OfERF17、OfERF1–3、OsLG3和ERF.D3；正调控包括GmENS1、GmENS2和OfERF017。功能差异可能与组织特异性、下游靶基因集合及激素信号层级有关。研究结论翻译：综上，本研究系统鉴定了百合AP2/ERF基因家族，揭示了其进化特征和表达模式，并证明LhERF061作为衰老负调控因子在延缓切花百合衰老中发挥重要作用。这些发现为百合分子育种和切花保鲜提供了重要基因资源和理论依据。作者贡献声明中，Xuan Hao负责写作原始草案、调查、数据管理；Cheng Liu负责方法学、调查、数据管理；Minghua Deng负责写作审阅编辑、写作原始草案、资源、项目管理、调查、概念化；Jinfen Wen负责写作审阅编辑、写作原始草案、项目管理、方法学、调查、基金获取、概念化。