引言
由病原细菌引起的食源性疾病仍然是全球主要的公共卫生问题，对人类健康构成重大威胁，并在全球范围内造成巨大的经济负担[1], [2]。在众多食源性病原菌中，沙门氏菌属尤为令人担忧，因为它们对环境的耐受性强、感染剂量低且在多种环境中繁殖迅速[3], [4]。在众多已鉴定的血清型中，鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）是最常见的之一，通常与受污染的鸡蛋、乳制品和肉类有关。感染这种病原体可导致腹泻、严重的全身感染、毒血症，甚至使易感人群死亡[5], [6]。因此，开发快速、便携、准确和灵敏的S. Typhimurium检测方法对于食品安全控制和及时病原体识别具有重要意义。
培养分离法仍然是S. Typhimurium检测的参考方法；然而，该方法劳动强度大、周转时间长且样品前处理繁琐[5]。酶联免疫吸附测定（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）虽然被广泛采用，但通常需要专业仪器、经过培训的人员和相对较长的周转时间，从而限制了其现场检测的适用性[7], [8]。为了解决这些局限性，研究人员开发了多种替代检测策略，包括电化学[9]、荧光[10]、比色[11]、光电化学[12]、侧向流免疫层析试纸条（LFA）[13]和表面增强拉曼散射（SERS）方法[14]。在这些方法中，由于响应迅速、成本低廉、操作简单且便于携带[15], [16]，LFA已成为最具吸引力的即时检测（POC）平台之一。然而，传统的病原体检测LFA通常使用抗体作为识别元件，并依赖肉眼判读单一的比色信号。合适抗体的可用性和稳定性可能会限制检测性能，而单读数格式可能限制分析灵敏度和定量准确性[17]，从而限制其在复杂基质中的应用。
与基于抗体的识别相比，成对间隔规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关（Cas）系统能够实现高度特异性和可编程的目标识别，近年来不仅成为基因组编辑的重要工具，也成为生物传感和分子诊断的重要工具[18]。在Cas家族中，Cas12a引起了广泛关注，因为其CRISPR RNA（crRNA）在识别靶DNA后，会对周围单链DNA（ssDNA）报告分子表现出附带的反式切割活性，从而实现高效的信号生成和放大[19], [20], [21]。此外，Cas12a在等温和温和反应条件下工作，使其与便携式分析平台高度兼容[22], [23]。这些特性促进了CRISPR/Cas12a与LFA的整合，使其成为增强病原体检测灵敏度、特异性和现场适用性的有前景的策略。
尽管具有这些优势，仅基于CRISPR/Cas12a的检测可能仍不足以检测低丰度靶标，这凸显了将其与核酸扩增策略相结合以进一步提高分析灵敏度的必要性[24], [25]。在此背景下，重组酶聚合酶扩增（RPA）和杂交链反应（HCR）分别代表目标扩增和信号扩增的有效方法。RPA是CRISPR/Cas12a辅助检测中最广泛使用的等温扩增方法之一，因为它在37-42℃下工作，可在15-20分钟内完成，提供了一种快速便捷的目标扩增手段[26]。RPA和CRISPR/Cas12a的结合实现了靶核酸的双重识别，从而提高了检测灵敏度和特异性[27]。与此同时，HCR是一种无酶的等温信号扩增策略，其中启动链通过一系列碱基配对级联，依次触发两个亚稳态发夹探针自组装成双链DNA聚合物[28]。通过将信号报告标签引入HCR产物中，可以有效增强检测平台上的信号积累[29], [30]。由于其温和的工作条件、简单的设计和低成本，HCR已成为生物传感应用中信号扩增的有吸引力策略[31]。
迄今为止，研究人员已开发了多种基于CRISPR的LFA方法来检测病原细菌。例如，Wu开发了一种RPA-CRISPR/Cas13a-LFA方法，用于视觉检测结核分枝杆菌[32]。相比之下，Xiong等人建立了一种灵敏的基于荧光的RPA-CRISPR/Cas12a-LFA平台，用于检测金黄色葡萄球菌[33]。然而，大多数病原体检测LFA平台仍依赖单一读数模式，缺乏内置的信号水平验证，这可能会在复杂基质或资源有限的情况下影响分析可靠性[34], [35], [36]。将多种信号输出整合到单一LFA平台中可以在信号转导水平上提供互补确认，从而提高检测可靠性[15]。此外，多读数分析可以结合不同信号模式的互补优势，使检测更适用于不同的应用场景[37], [38]。因此，研究人员开发了具有双比色/荧光或比色/SERS读数的基于CRISPR的LFA[39], [40]；然而，这些平台通常依赖特殊设计的纳米标签，这可能会增加探针制备的复杂性。
在这方面，AuNPs特别有吸引力，因为作为经典且易于制备的LFA报告分子，它们固有地具有多种适用于信号转导的物理化学性质。其局域表面等离子体共振（LSPR）会产生强烈的可见颜色，使其成为比色LFA中最广泛使用的报告分子之一[41], [42]。同时，AuNPs可以作为荧光猝灭剂并通过局域电磁场增强来增强拉曼散射，使其分别应用于基于荧光和SERS的检测中[17], [43], [44], [45]。这些多功能特性为构建用于现场分析的多读数LFA平台提供了实用基础。据我们所知，AuNP基的LFA在单一检测线上同时整合比色、荧光和SERS读数用于食源性病原体检测的报道仍然很少，留有巨大的发展空间。这种三重读数格式在单次样品应用后从同一识别事件产生三个光学上不同但相互关联的信号。比色通道能够实现快速视觉筛选，而荧光和SERS通道提供更灵敏的定量检测。总的来说，这些互补的读数方式提供了信号水平的印证，提高了在复杂基质中或需要更高分析置信度时的结果可靠性。主要权衡之处在于荧光和SERS测量需要额外的读数设备，从而增加了仪器复杂性。因此，这三个通道是作为可选择而非强制的读数方式，可以根据具体检测场景、可用设备、所需灵敏度和期望置信度水平来决定使用。
受这些考虑因素的启发，本研究开发了一种CRISPR/Cas12a驱动的三重读数侧向流免疫层析试纸条，整合了HCR，用于快速、灵敏、准确地检测鼠伤寒沙门氏菌。如图1所示，所提出的平台利用AuNPs的比色、荧光猝灭和SERS增强特性在单一检测（T）线上产生三种互补的光学信号。HCR被整合到LFA中以促进信号报告探针在试纸条上的组装并进一步放大检测信号。同时，RPA-CRISPR/Cas12a模块被设计为特异性识别鼠伤寒沙门氏菌靶序列，从而确保高度选择性。在不同的激发和读数条件下，所开发的检测能够通过比色、荧光和SERS输出实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测，从而满足多样化的分析需求。通过添加鸡蛋和牛奶样品进一步评估了平台的实际适用性，证明了在真实食品基质中的满意准确度和重复性。本研究为开发高灵敏度的多读数LFA平台以现场检测食源性病原体提供了一种有前景的策略。
