三糖增强的一锅法RPA-CRISPR/Cas12b检测技术，用于快速检测麦芽布鲁氏菌（Brucella melitensis）和流产布鲁氏菌（Brucella abortus）

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Trehalose-enhanced one-pot RPA-CRISPR/Cas12b assay for rapid detection of Brucella melitensis and Brucella abortus

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  基于海藻糖强化的RPA-CRISPR/Cas12b系统分别用于检测羊布鲁氏菌（B. melitensis）和牛布鲁氏菌（B. abortus）。
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  海藻糖可将检测灵敏度提高10倍，并加速反应动力学。
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  使用81份临床样本进行验证，与PCR方法的一致性分别为98.21%和100%。
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  双荧光和LFB读数功能可在50分钟内实现快速即时检测（POCT）。

引言

布鲁氏菌病是一种全球范围内普遍存在的动物源传染病[1]。它对公共卫生和畜牧业仍然构成持续威胁，尤其是在地中海、中东、拉丁美洲、亚洲和非洲等地区[2]。该病的致病菌为布鲁氏菌属（Brucella），属于革兰氏阴性、兼性入侵细胞细菌。目前，布鲁氏菌属至少包含12个已确认的物种，其中包括具有临床意义的病原体羊布鲁氏菌（B. melitensis）、牛布鲁氏菌（B. abortus）和猪布鲁氏菌（B. suis）。其中，羊布鲁氏菌和牛布鲁氏菌被认为是毒性最强的物种，也是全球疫情的主要原因[3]、[4]。人类布鲁氏菌病的症状复杂且不具特异性，常常发展为慢性病，导致诊断困难和高复发率[4]、[5]。因此，它对人类健康构成重大威胁，并给畜牧业造成巨大经济损失。有效的防控依赖于早期识别和扑杀受感染的牲畜[6]。在资源有限的 pastoral 地区，这一问题尤为严重，因为这些地方缺乏标准的实验室诊断设施，阻碍了有效的疫情监测。因此，开发用户友好、准确且快速的即时检测（POCT）方法对于及时控制疫情至关重要。

布鲁氏菌病的诊断需要结合流行病学史、临床症状和实验室检测结果。现有的实验室方法包括细菌分离和培养、血清学检测以及分子诊断[7]。然而，常用的血清学检测方法无法区分不同种类的布鲁氏菌。虽然金标准的培养方法速度快，但需要高生物安全等级（BSL-3）的设施，不适合快速追踪[8]。虽然多重PCR等分子技术显著提高了检测速度，但它们依赖于精密的热循环仪、训练有素的技术人员以及受控的实验室环境，这限制了其在边境检查点或农场等资源受限场合的应用[9]。此外，现有的检测方法通常涉及多步骤的开放管操作，增加了污染风险，并且缺乏简单的封闭管分型能力。因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性、对仪器依赖性低且适合即时检测的布鲁氏菌检测和分型方法。

异温扩增技术，如重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导的异温扩增（LAMP）和滚环扩增（RCA），已被广泛用于流行病原体的即时检测[9]、[10]、[11]。尽管这些方法可以在30分钟内提供结果，但它们的灵敏度有限，假阴性率较高，这阻碍了其广泛应用。 clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）技术最初用于基因编辑，但随着Cas12、Cas13和Cas9等蛋白的切割活性的发现，它也被引入到分子诊断领域[12]。例如，Cas12能够特异性地识别并切割目标双链DNA（dsDNA），从而引发附近单链DNA（ssDNA）报告分子的随机切割。CRISPR诊断技术通过先使用RPA、LAMP或RCA扩增目标序列，再利用Cas12-crRNA复合物和荧光ssDNA报告分子进行检测来实现。CRISPR与异温扩增技术的结合显著提高了病原体检测的灵敏度和特异性[13]、[14]。早期的CRISPR诊断平台（如DETECTR和HOLMES）采用两步流程：先扩增目标序列，再通过CRISPR进行检测。然而，这种两步流程增加了操作复杂性，延长了结果获取时间，并增加了扩增产物污染的风险[15]。人们尝试将扩增和CRISPR检测整合到单个封闭管中。一个关键挑战是早期RPA扩增产物可能会提前激活Cas12b，导致模板降解，从而降低灵敏度。我们之前开发的用于布鲁氏菌属物种的一罐法RPA-CRISPR/Cas12b检测方法也遇到了同样的问题[16]、[17]、[18]。为了解决RPA和CRISPR在单一封闭管中的兼容性问题，开发了几种时空调控策略。例如，使用光激活crRNA来延迟CRISPR的激活时间，直到扩增完成后[19]，或者利用相变材料进行物理隔离[20]。尽管这些方法可以提高性能，但它们通常会增加操作复杂性或成本，限制了其在资源有限、即时检测场景中的实际应用。先前的研究表明，使用针对非最优原型间隔序列（PAM）的Cas12a-crRNA复合物可以降低其切割活性，从而有利于开发一罐法检测[21]。这种方法因其操作简便和速度快而具有前景。然而，它需要针对非最优PAM序列设计多个crRNA以实现最佳灵敏度，并且不适用于其他Cas蛋白（如AapCas12b），这也是我们之前研究中的一个限制[16]。虽然上述的时空隔离和分子工程策略可以减少一罐法检测中的干扰，但它们往往会影响易用性或成本，或限制了其广泛应用。因此，探索一种更简单、更通用的策略来提高兼容性是至关重要的，这种策略不应依赖于复杂的工程或专用设备。在这种情况下，化学添加剂是一个尚未充分研究的但有前景的方向。虽然甘油[22]和肝素钠[27]已被证明可以调节一罐法CRISPR反应，但海藻糖（一种众所周知的酶稳定剂）在增强一罐法RPA-CRISPR兼容性方面的潜力尚未得到系统研究。

最近，通过添加剂的物理或化学效应来调节反应动力学的策略因其简单性和潜在的普遍性而受到关注。研究表明，甘油或琼脂糖水凝胶的粘度可以延缓Cas12检测区和RPA扩增区之间的组分扩散[22]、[23]、[24]，从而提高灵敏度。同样，海藻糖和DMSO等稳定剂可以通过保护酶活性和微调反应条件来提高RPA的效率和稳健性[25]、[26]。更多突破性研究表明，带负电荷的多糖肝素钠可以可逆地抑制Cas12蛋白的活性；它通过在反应早期结合并掩盖Cas12蛋白，随后被积累的扩增产物通过竞争性结合置换[27]。总体而言，这些发现表明，合理筛选和添加合适的化学添加剂为协调RPA扩增和Cas12b检测的反应动力学提供了一种直接且有前景的方法，从而克服了一罐法检测的灵敏度瓶颈。

因此，我们开发了一种海藻糖强化的单罐法RPA-CRISPR/Cas12b检测方法，用于快速检测和区分羊布鲁氏菌（B. melitensis）和牛布鲁氏菌（B. abortus）。这是通过系统筛选和优化化学添加剂实现的，海藻糖被确定为提高检测兼容性和灵敏度的关键添加剂。该方法操作简单，准确性高。结合实时荧光和LFB双通道读数功能，它为快速现场检测和区分羊布鲁氏菌和牛布鲁氏菌提供了一个直观可靠的视觉平台，也为其他病原体的现场分子诊断提供了新的思路。

章节片段

主要试剂和仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒购自TaKaRa（日本京都）。DNA异温扩增试剂盒来自Amplify Future Biotech Co., Ltd.（中国常州）。侧向流式生物传感器（LFB）条带购自Wobio Biotech Co., Ltd.（中国南京）。QIAamp DNA Blood Mini试剂盒来自Kai Jie Technology Development Co., Ltd.（中国北京）。AapCas12b核酸酶购自ToloBio Biotech Co., Ltd.（中国上海）。所有

RPA-CRISPR/Cas12b检测方法的示意图

该检测方法包括两个主要步骤：快速样本准备步骤（约20分钟），随后是RPA-CRISPR/Cas12b反应（约30分钟）。所有反应组分——缓冲液A、引物、Cas12b、ssDNA报告分子、海藻糖、无核酸酶的水、目标DNA和缓冲液B都合并在一个试管中，在43℃下孵育30分钟，以进行实时荧光和LFB检测。该过程主要包含两个集成部分：基于RPA的扩增和CRISPR/Cas12b介导的检测

讨论

作为一种全球分布的动物源传染病，布鲁氏菌病的有效防控依赖于快速准确的诊断[1]、[2]。现有的金标准方法（细菌分离和培养）操作繁琐、耗时较长，并存在显著的生物安全风险。同时，标准分子诊断方法（如PCR）依赖于精密仪器和受控的实验室环境，不适合用于即时检测或现场应用[7]、[8]、[9]。

结论

本研究结合了RPA和基于CRISPR的检测技术，开发了两种针对羊布鲁氏菌（B. melitensis）和牛布鲁氏菌（B. abortus）的单罐法RPA-CRISPR/Cas12b检测方法，可在30分钟内获得结果。这些方法准确、快速、灵敏度高且用户友好，具有视觉读数功能。它们为快速鉴定羊布鲁氏菌和牛布鲁氏菌提供了可靠高效的工具，并为其他病原体的快速筛查提供了可转移的方法框架。

CRediT作者贡献声明

Yong Hu：撰写——原始草稿、验证、数据整理。Xiaoyu Wei：验证、数据整理。Fengming Chen：验证、数据整理。Yue Wang：验证、方法学、数据整理。Xinggui Yang：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、数据整理。Yongfu Chen：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、验证、方法学、数据整理。Shijun Li：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、项目管理、方法学、资金支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（编号82273758）、中国公共卫生人才培养项目（Guo Jikong Zong Ren Han [2024]122）、贵州省卫生委员会（gzwkj2024-055）以及在中国中央委员会指导下贵州省的地方科学基金（No.Qiankehe〔2025〕024）的财政支持。此外，还得到了贵州省微生物与传染病预防控制重点实验室（Qiankehe Platform）的支持

Yongfu Chen|Xinggui Yang|Yue Wang|Fengming Chen|Xiaoyu Wei|Yong Hu|Shijun Li