《Communications Chemistry》：Progress and challenges in traceless ligand-directed labelling chemistry
蛋白质的无痕配体导向标记（traceless ligand-directed labelling, t-LDL）正在成为一种潜在策略，用于应对在天然细胞环境中研究生物学所面临的挑战。通过利用邻近驱动反应性（proximity-driven reactivity），t-LDL 能够将小功能基团选择性转移至远离经典结合位点或活性位点的残基，并允许递送配体在标记后解离。本综述总结了 t-LDL 化学的发展，重点关注转移型（transfer）和催化剂束缚型（catalyst-tethered）策略。其强调了近期关键进展，这些进展拓展了 t-LDL 的机制范围和功能范围，同时指出了进一步发展的突出挑战和机遇。活细胞成像、蛋白质组学、邻近诱导翻译后修饰（post-translational modification, PTM）和信号重编程中的应用示例，展示了该标记技术日益增长的机会。
Introduction（引言）
人类蛋白质组预计约20,000种蛋白质，参与蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions, PPIs）、信号级联和代谢过程。蛋白质标记对理解生物分子机制、绘制PPI网络和阐明疾病通路至关重要。过去20年，遗传学标记方法如绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）融合、自标记蛋白标签（self-labelling protein tags, SLPs）如 SNAP-tag 和 HaloTAG、邻近标记 BioID、遗传密码扩展以及 APEX/TREX 等提供了特异性，但常需要工程化细胞、遗传操作限制于C端或N端、融合蛋白增加质量并可能影响定位、伴侣识别、动力学和功能。因此，可在最小扰动环境中分析蛋白质的化学探针受到关注。
Covalent protein and ligand-directed chemistry（共价蛋白质与配体导向化学）
共价调节剂（covalent modulators）含反应基团（warhead）连接配体，弱亲电中心与靶蛋白亲核残基反应，常见Cys和Lys，也扩展到Tyr、Thr、Ser。共价结合可提高效力、选择性和作用持续时间。配体导向标记（ligand-directed labelling, LDL）利用配体选择性驱动化学反应，用于靶点验证和脱靶识别，常与基于质谱的化学蛋白质组学结合。活性依赖蛋白质谱（activity-based protein profiling, ABPP）在活性位点标记，破坏酶功能，限制天然功能研究；近期扩展到活性位点外的“可配体化”位点。t-LDL 旨在最小化对结构、功能和定位的干扰。
‘Traceless’ ligand-directed labelling chemistry（“无痕”配体导向标记化学）
t-LDL 依赖邻近辅助速率增强，通过配体选择性、linker 和 warhead 化学选择性，将小标记基团转移到远离活性或经典结合位点的残基，标记后配体解离。其关键参数（标记速率、二级速率常数）与共价抑制剂类似。t-LDL 分为转移型 t-LDL（transfer t-LDL）和催化剂束缚型 t-LDL（catalyst-tethered t-LDL）。前者 warhead 在反应中裂解并转移标签；后者 warhead 为催化基团，驱动残基与独立探针或标签反应。
Transfer t-LDL（转移型 t-LDL）
早期 Hamachi 等将糖通过可裂解二硫键连接二氮丙啶（diazirine），光诱导邻近交联后二硫键还原释放配体，新引入硫醇可偶联荧光团。Horne 等用于结构蛋白质组学，Li 等用于翻译后修饰（post-translational modification, PTM）依赖的表观遗传PPI分析。局限包括二氮丙啶交联非特异和需还原步骤，推动单步、位点及氨基酸选择性转移化学发展。
Cysteine-targeting warheads for transfer t-LDL（靶向半胱氨酸的转移型 t-LDL 弹头）
经典Cys warhead如丙烯酰胺、环氧化物和芳基卤化物多不适于t-LDL。5-磺酰基四唑连接环孢素A可标记亲环蛋白A。London 组开发共价配体导向释放（covalent ligand-directed release, CoLDR）化学，α-取代甲基丙烯酰胺 warhead 可实现Cys靶向转移，用于“turn-on”荧光探针及BTK、K-Ras、SARS-CoV-2 木瓜样蛋白酶标记；标记BTK不损害酶活。磺胺酸酯乙酰胺、肽-高价碘试剂、锍探针也用于Cys。Pergu 等的磷酸化诱导嵌合小分子（phosphorylation-inducing chimeric small molecules, PHICS）将激酶抑制剂、甲基丙烯酰胺和JQ1连接，诱导激酶招募BET家族蛋白（如BRD4）并磷酸化，代表信号重编程应用。
Lysine-targeting warheads for transfer t-LDL（靶向赖氨酸的转移型 t-LDL 弹头）
Lys 表面丰度（5.9%）高于Cys（2.3%），Hamachi 组开创多种Lys靶向t-LDL。化学包括烷基化、亲核芳香取代（nucleophilic aromatic substitution, S
NAr）和重氮转移，但多数为酰化。配体导向甲苯磺酰（ligand-directed tosyl, LD-T）、酰基咪唑（ligand-directed acyl imidazole, LD-AI）和二溴苯基苯甲酸酯（LD-dbb）用于体外、细胞和体内标记。LD-T 可标记His、Glu、Asp、Tyr、Cys；Tamura 等用双功能LD-T探针在细胞内下拉FKBP12结合伴侣，首次用LDL探针追踪细胞PPI。酰化策略包括简单酯、marinopyrrole邻酚酯标记actin Lys115、KHAc转移乙酰基至PGAM1 Lys100、GPCR标记试剂、双链核酸和SEAlide的N>S酰基转移。LD-AI形成氨基甲酸酯，标记细胞表面和突触受体；苯并三唑替代咪唑。N-酰基-N-烷基/芳基磺酰胺（NASA/ArNASA）是广泛采用的warhead，NASA对Lys选择且动力学快，ArNASA第二代提高水解稳定性和特异性。NASA/ArNASA用于GPCR、激酶、MMP12、共价抑制剂、光控酶、高通量筛选、MALDI和靶向蛋白降解；Deiters 组用NASA-适配体标记PTK7；Beerkens 等用NASA标记GPCR但存在非特异性和报告标签抑制激活，ArNASA可改善。SuFA warhead降低反应性，提高选择性。
Other Lysine-Reactive Chemistries（其他赖氨酸反应化学）
S
NAr 氨基吡喃鎓荧光团可标记Protein A；O-硝基苯并二唑（O-NBD）用于组蛋白、turn-on荧光和smoothened受体标记。醛的还原胺化用于两步标记，双链置换或可裂解linker策略。BioY/链霉亲和素与生物素化咪唑-1-磺酰叠氮实现Lys位点特异性重氮转移。
Tyrosine-targeting chemistry for transfer t-LDL（靶向酪氨酸的转移型 t-LDL 化学）
Tyr酚侧链亲核性较低，开发难度大。磺酰氟交换（sulfonyl-fluoride exchange, SuFEx）和硫三唑交换（sulphur-triazole exchange, SuTEx）是代表性化学。SuTEx主要靶向Tyr（部分Lys），三唑离去基团提高反应性和化学选择性并可调。SuFEx/SuTEx中硫保留在靶残基上，配体需连接离去基团；SuFEx的氟离去基团限制t-LDL设计。适配体SuFEx标记凝血酶后互补链释放。Witte 组利用亚氨基硼酸酯可逆共价和磺酰氟warhead，标记后被胺裂解，用于碳酸酐酶2和BioY，实际标记Lys。SuTEx用于化学蛋白质组学、超反应性Tyr分析和化学磷酸蛋白质组学，激酶选择性探针可在活细胞和裂解液中无痕标记。N-磺酰基吡啶酮也偏好Tyr并部分Lys，用于多种蛋白；O-NBD、N-磺酰基吡啶酮和NASA在CB2R中比较。
Chemistry for t-LDL on other amino acids（其他氨基酸的 t-LDL 化学）
Kojima 等用炔酸酯探针与亲核氨基酸反应生成香豆素并开启荧光，用于维生素D受体（VDR）的His标记以及VDR和PPARγ的拟议Lys标记。Liu 和 Melman 用Baylis-Hillman酯连接镍-次氮基三乙酸结合六组氨酸标签并烷基化咪唑。Kurbanov 等用带吡啶鎓离去基团的可触发Michael受体标记His、Lys和Ser，用于结合位点映射。
Summary of transfer t-LDL chemistries（转移型 t-LDL 化学总结）
转移型 t-LDL 的优势在于通过warhead化学选择性靶向特定残基，已用于复杂生物系统研究和调控，如PHICS和NASA家族。挑战包括warhead稳定性、特异性、作用方式、反应性、邻近氨基酸可用性、配体亲和力、on/off-target反应性、局部环境（含pH）、标记速率、linker性质以及标记对结构和功能的影响。由于依赖邻近辅助速率增强，难以仅凭warhead内在反应性预测适用性。近期对亲电试剂活化（latency）的系统研究比较了酰基咪唑、NASA和SuFEx的分子间和失活速率。系统比较不同模型蛋白中的warhead选择性和动力学仍有限。NASA系列标记快，可分析有丝分裂等时间尺度过程。
Catalyst-tethered t-LDL（催化剂束缚型 t-LDL）
催化剂束缚型 t-LDL 与转移型并行发展，配体连接催化剂，标签独立。有机催化如Hamachi组亲和导向DMAP（affinity-guided DMAP, AGD）探针，将DMAP连接糖识别基团，加入酰基供体后催化酰基转移标记凝集素。AGD对酰基供体结构敏感、易水解、速度慢且需碱性条件，但已用于活细胞膜蛋白和细胞表面糖蛋白。Song 等降低酰基供体反应性并采用多催化剂，实现细胞内FKBP12标记。亲和导向肟（affinity-guided oxime, AGOX）用亲核吡啶鎓肟替代DMAP，配合NASA酰基供体，标记脑组织AMPAR，并扩展到肽配体。Kanai 组DMAP-SH（DSH）结合硫酯酰化试剂在活细胞中酰化组蛋白，后续可用乙酰辅酶A。有机金属催化方面，Ball 等用二铑四羧酸盐催化色氨酸C-H插入，用于卷曲螺旋、抗体功能化和STAT3配体结合位点鉴定。
Photocatalytic t-LDL（光催化 t-LDL）
光催化t-LDL有两种形式：配体连接光催化剂激活POI残基以捕获功能化标签，或光催化剂激活标签以捕获靶蛋白残基。Ru(bpy)
3介导的单电子转移（single-electron transfer, SET）是代表性方法。Kodadek 组报道[Ru(bpy)
3]
2+在氧化条件下交联蛋白；机制涉及过硫酸盐氧化光激发态[Ru(bpy)
3]
2+*生成[Ru(bpy)
3]
3+和硫酸根自由基，Tyr向Ru(III)发生SET生成酪氨酰自由基，与邻近亲核残基反应。Sato和Nakamura用Ru(bpy)
3连接配体标记碳酸酐酶，并用于细胞EGFR，但存在脱靶和氧化降解；改用1-甲基-4-芳基尿唑可缩短自由基寿命和标记半径。Beard等用BH3肽模拟物连接Ru(bpy)
3选择性标记MCL-1，优先标记Cys，也用于活性氧（reactive oxygen species, ROS）诱导失活。MacMillan和Muir组开发μMap，用铱光催化剂激发二氮丙啶生成卡宾，标记BSA及抗体锚定的VEGFR2、CD45、CD47、CD29和PD-L1。μMap通过Dexter能量转移，二氮丙啶半衰期（t
1/2）约2 ns，标记半径<4 nm，时空分辨率优于BioID和APEX。该策略扩展到小分子光催化剂、氮宾（t
1/2约10 ns）、锍重氮标签、HaloTag/氯烷烃铱光催化剂、聚集蛋白互作组和生物过程分析。Lin等MultiMap用单一光催化剂和不同半径光探针实现多尺度互作组分析。DarT标记使用脱氮黄素-二氮丙啶能量转移，结合HaloTag/氯烷烃或环状细胞穿透肽。Scinto等用生物正交四嗪连接实现光催化t-LDL并调节标记半径。
Summary of catalyst-tethered t-LDL chemistries（催化剂束缚型 t-LDL 化学总结）
催化剂束缚型t-LDL与转移型并行发展，优势包括将配体与报告标签分离，模块化引入多种功能，如Raynal等的肽配体平台和Fujiwara等的活细胞组蛋白乙酰化。光催化系统更依赖邻近效应而非化学选择性，μMap因卡宾高反应性几乎完全依赖邻近。该策略适用于高时空分辨互作组映射，但有机催化t-LDL仍受脱靶反应性困扰，光催化t-LDL报告邻近而非直接物理相互作用。两类t-LDL互补。
Outlook（展望）
近十年t-LDL成为化学生物学有前景的工具，可在内源环境研究天然蛋白，并利用已知配体和抑制剂设计探针。t-LDL适用范围显著扩展：适用warhead增多、更特异可调、可靶向更多残基且机制多样。NASA/ArNASA、甲基丙烯酰胺和SuTEx分别代表Lys、Cys和Tyr的有力工具；催化剂束缚型如μMap提供窄半径快速标记。未解决问题包括：配体特异性和warhead化学选择性之间的关系尚未全面研究；标记时标和标签在细胞内的寿命未充分探索；复杂或功能性标签的下游效应需进一步表征；标记后配体再结合对靶蛋白的影响需研究。应用包括连接生物正交反应手柄用于成像或下拉、蛋白质组学、离去基团“turn-on”荧光定量，以及转移二级功能基团或合成模拟PTM的“重编程”模式。总体而言，t-LDL前景广阔。
