《Cells》：Changes in Core Temperature Following Administration of FC5, a Blood–Brain Carrier Fused with Neurotensin in Mice, Rats and Non-Human Primates
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中枢神经系统疾病的治疗和药物管理受到高选择性血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的显著阻碍。受体介导的跨细胞转运（receptor-mediated transcytosis，RMT）已被证明是一种能够将多种治疗性药物递送穿越BBB的稳健
中枢神经系统疾病的治疗和药物管理受到高选择性血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的显著阻碍。受体介导的跨细胞转运（receptor-mediated transcytosis，RMT）已被证明是一种能够将多种治疗性药物递送穿越BBB的稳健机制。本研究描述了一种基于神经降压素（neurotensin）的药效学模型，用于评估FC5（一种已被充分表征的RMT穿梭载体）的脑穿透能力。研究人员构建了FC5与人Fc片段及神经降压素的融合分子，并证明包含FC5（FC5Fc-neurotensin）或非BBB穿越对照（A20.1Fc-neurotensin）的完整但非C末端截短的神经降压素蛋白仍保留激活神经降压素1型受体（neurotensin receptor type 1，NTS1）的能力。在体内研究中，静脉注射FC5Fc-neurotensin（而非单独的神经降压素或A20.1Fc-neurotensin）在大鼠和小鼠中均诱导了核心体温的下降。研究人员进一步将这些发现扩展至非人灵长类（non-human primates，NHP），证明了FC5在该物种中穿越BBB的能力。总体而言，研究结果进一步支持了FC5在跨BBB递送载荷方面的潜力。神经降压素低体温模型也被验证为一种评估脑递送的药效学方法，尽管在体内评估前需要对融合构建体的分子表征进行必要的考量。
论文解读
一、研究背景与目的
中枢神经系统疾病的药物治疗长期面临一个核心瓶颈——血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的高度选择性限制。BBB在维持神经稳态和中枢神经系统（central nervous system，CNS）完整性方面发挥着关键防御作用，但同时也阻碍了绝大多数治疗药物的脑内递送。无论是小分子药物还是肽类、蛋白质、抗体及核酸类药物，均难以有效穿越BBB，这严重制约了CNS疾病治疗方法的开发。
受体介导的跨细胞转运（receptor-mediated transcytosis，RMT）已被证实是一种能够将多种治疗性药物递送穿越BBB的稳健机制。目前已发现多个可用于增强BBB药物递送的受体系统，包括转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、胰岛素受体（insulin receptor，IR）、低密度脂蛋白受体相关蛋白1（low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1）、胰岛素样生长因子受体（insulin-like growth factor receptors，IGF1R）以及跨膜蛋白30A（transmembrane protein 30A，TMEM30A/CDC50A）等。
然而，BBB载体开发面临的一个重要挑战是：不仅要证明候选载体能够穿越BBB，还要证明其能够将药理活性载荷以足够浓度递送至CNS并诱导可测量的药效学反应。此外，跨物种转化能力的局限性也显著增加了CNS药物从临床前研究推进至临床试验的失败率。因此，在多物种中验证BBB载体的活性，对于确立其在脑递送应用中的转化潜力至关重要。
二、研究内容与主要结论
本研究利用基于神经降压素的药效学模型，系统评估了FC5——一种靶向TMEM30A的已知RMT载体的脑穿透能力。FC5是一种单域抗体（VHH），最初通过功能性淘选噬菌体展示的羊驼VHH文库获得，因其能够内化进入人脑内皮细胞（brain endothelial cells，BEC）而被选中，并已被证明在体外和体内均能穿越BBB。
研究人员构建了FC5与人Fc片段及神经降压素的融合蛋白（FC5Fc-neurotensin），并以非BBB穿越对照抗体A20.1Fc融合神经降压素（A20.1Fc-neurotensin）作为阴性对照。研究结果表明，静脉注射FC5Fc-neurotensin在小鼠和大鼠中均诱导了显著且持久的核心体温下降，而单独的神经降压素或A20.1Fc-neurotensin则无此效应。更重要的是，研究人员将该模型扩展至非人灵长类（non-human primates，NHP），首次证明了FC5在灵长类物种中穿越BBB并递送功能性载荷的能力。
三、关键技术方法
本研究采用了多项关键技术手段。在蛋白表达与表征方面，研究人员利用中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）稳定细胞系表达融合蛋白，并通过分子排阻色谱（size-exclusion chromatography，SEC）、SDS-PAGE及完整蛋白液相色谱-电喷雾电离-质谱联用（LC-ESI-MS）进行纯度和完整性鉴定。在体外功能验证方面，采用PathHunter eXpress NTR1试剂盒检测NTS1受体激活能力。在体内药效学评估方面，在大鼠和小鼠腹腔植入温度数据记录仪（telemetry），在非人灵长类中植入遥测发射器，持续监测核心体温变化。在脑递送定量分析方面，采用纳升液相色谱-选择反应监测质谱（nanoLC-SRM）定量血清、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）及去血管脑实质中的蛋白浓度。此外，还运用原位脑灌注（in situ brain perfusion，ISBP）结合近红外荧光标记技术评估BBB完整性。动物来源方面，大鼠和小鼠购自加拿大Charles River Laboratories，食蟹猴（Cynomolgus monkeys）同样购自Charles River Laboratories（Laval，QC，Canada）。
四、研究结果
4.1 A20.1Fc和FC5Fc融合神经降压素的表征
研究人员在稳定CHO细胞系中表达了A20.1Fc和FC5Fc与神经降压素C末端融合的构建体。SEC谱图和SDS-PAGE分析表明所得蛋白纯度较高，内毒素水平低，适合体内实验。细胞水平NTS1激活实验显示，两种融合蛋白的浓度-反应曲线与游离13氨基酸神经降压素相比仅出现轻微右移，差异无统计学意义。值得注意的是，在瞬时转染CHO-3E7细胞中表达的构建体出现了神经降压素C末端截短，丢失了末端Ile-Leu残基，导致NTS1激活能力受损。这一发现强调了融合蛋白生产过程中严格质量控制的重要性。
4.2 神经降压素单独或与A20.1Fc和FC5Fc偶联后对核心体温的影响
在小鼠实验中，单独注射神经降压素（1.79 μmol/kg）不引起核心体温变化；注射A20.1Fc-neurotensin（241 nmol/kg）同样无体温效应，与其无法穿越BBB的特性一致。而FC5Fc-neurotensin（241 nmol/kg）静脉注射后诱导了持续长达5小时的显著体温下降。在大鼠剂量依赖性研究中，FC5Fc-neurotensin在120 nmol/kg和241 nmol/kg两个剂量下均诱导了时间和剂量依赖性的体温降低，而神经降压素单独或A20.1Fc-neurotensin均无此效应。研究人员进一步从体温-时间曲线中提取了最大效应、曲线下面积（area under the curve，AUC）和反应持续时间三个定量参数，均显示FC5Fc-neurotensin与阴性对照之间存在统计学显著差异。
通过nanoLC-SRM质谱分析，在注射241 nmol/kg剂量6小时后，FC5Fc-neurotensin在脑脊液（1.66 ± 0.22 nM vs. 0.33 ± 0.06 nM）和去血管脑实质（11.13 ± 2.01 nM vs. 1.27 ± 0.37 nM）中的浓度均显著高于A20.1Fc-neurotensin，分别提高约5倍和9倍，而血清水平两者相当，进一步证实了FC5构建体的BBB穿越能力。
4.3 低体温对BBB完整性的影响
为排除低体温本身可能改变BBB完整性的干扰，研究人员给小鼠注射了高剂量（5 mg/kg）的PD149163——一种可穿越BBB的小分子NTS1激动剂，诱导了持续长达9小时的显著体温降低（最低温度28.14 ± 0.41 °C）。在给药4小时后通过原位脑灌注（ISBP）评估A20.1Fc-CF790的脑摄取，结果显示PD149163处理组与生理盐水对照组之间无差异，表明低体温并未可测量地影响BBB完整性。作为阳性对照，使用22%甘露醇渗透性破坏BBB后，A20.1Fc-CF790的脑内荧光信号显著增加，验证了ISBP技术的有效性。
4.4 非人灵长类中的神经降压素诱导低体温
研究人员将神经降压素低体温模型扩展至食蟹猴。采用保守的给药方案：三次静脉注射（每次120 nmol/kg），间隔60分钟。FC5Fc-neurotensin在第二次和第三次注射后诱导了可测量的核心体温下降（最大降幅分别约为0.6 °C和0.85 °C），而A20.1Fc-neurotensin未产生低于基线的体温降低。统计分析显示，FC5Fc-neurotensin的最大效应、AUC和反应持续时间均与A20.1Fc-neurotensin存在显著差异。血清药代动力学分析显示，两种融合蛋白均呈现双相下降，符合二室模型。FC5Fc-neurotensin的AUC0-∞（65 nmol×h/mL）较A20.1Fc-neurotensin（85 nmol×h/mL）低约20%，表明FC5Fc-neurotensin的体温效应并非由更高的全身暴露所致，而是源于FC5增强的BBB穿越能力。
五、讨论与结论
本研究的讨论部分指出，神经降压素诱导的低体温模型作为一种功能性药效学读数，能够有效区分BBB穿越型与非穿越型分子。该模型的主要优势包括：通过遥测设备植入实现不依赖操作者的读数、可跨物种转化（涵盖小鼠、大鼠和非人灵长类）。研究还强调了融合蛋白生产中C末端截短问题的重要性——神经降压素的C端六肽（8-13）是其高亲和力结合和完全激动NTS1受体所必需的结构域，CHO细胞中表达的羧肽酶和内肽酶可能导致神经降压素降解，因此严格的质量控制是体内实验前的必要步骤。
研究人员还指出，NHP中低体温反应的幅度较啮齿类动物温和，这归因于物种间体温调节生理学的根本差异，包括体表面积与质量比、代谢率、棕色脂肪组织相对丰度及全身热传导率的差异。较大的动物具有更高的热稳定性和更慢的核心温度变化速率。
研究结论表明，RMT策略在改善脑内药物生物利用度和增强多种药物疗效方面具有显著潜力。本研究通过神经降压素诱导的低体温模型，证明了FC5Fc在小鼠、大鼠和非人灵长类中经全身给药后能够将药理学活性载荷递送穿越BBB。该模型可作为评估候选BBB载体通透性的高效筛选方法，结合脑暴露的定量测量和适当的BBB完整性对照，为BBB载体的评估和优先级排序提供了稳健框架，有助于弥合临床前模型与临床转化之间的鸿沟。
