《Foods》：Probiotics as a Barrier Against Salmonella enterica and Escherichia coli in Contaminated Rice-Protein-Based Infant Formulas
编辑推荐：
背景/目的：婴儿配方奶粉中即使存在低于检测阈值的肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原体，仍构成健康风险。益生菌已被提出作为限制病原体增殖的策略。本研究评估了两种益生菌菌株（鼠李糖乳酪杆菌（L
背景/目的：婴儿配方奶粉中即使存在低于检测阈值的肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原体，仍构成健康风险。益生菌已被提出作为限制病原体增殖的策略。本研究评估了两种益生菌菌株（鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）HN001和长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）IM-1）在模拟条件下抑制这些病原体生长的能力。方法：使用复水婴儿配方奶粉进行测定，添加或不添加益生菌组合，并以低接种水平（1或10 CFU/10 g）挑战大肠杆菌或肠道沙门氏菌。共分析了8次试验中的112个样本，涵盖两个时间点（T0h和T18h）。通过16S rRNA基因V4区测序表征微生物组成，随后使用QIIME2和SILVA数据库进行生物信息学分析。结果：在无益生菌条件下，大肠杆菌和肠道沙门氏菌在测试条件下相对丰度显著增加（样本C1和C10），在T18h达到高相对丰度。相反，补充长双歧杆菌婴儿亚种IM-1和鼠李糖乳酪杆菌HN001的配方奶粉中，两种病原体的相对丰度显著降低，在大多数条件下检测不到或降至<1%。同时观察到有益菌属如乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus）和乳杆菌属（Lactobacillus）的同步增加，表明存在生态位和营养竞争。结论：益生菌长双歧杆菌婴儿亚种IM-1和鼠李糖乳酪杆菌HN001在低接种水平污染的婴儿配方奶粉中对大肠杆菌和肠道沙门氏菌发挥了增殖抑制作用，限制了病原体增殖并促进了有益微生物群的稳定性。这些发现表明，在所评估的实验条件下，添加益生菌可能限制婴儿配方奶粉中的病原体增殖。
论文解读
一、研究背景与问题
母乳被公认为婴儿的理想营养来源，可提供生长所需全部营养以及细胞因子、抗体和低聚糖等感染保护成分。当母乳喂养不可行时， powdered infant formula（PIF，婴儿配方奶粉）作为主要替代品，但配方奶喂养婴儿缺乏同等水平的免疫保护。新生儿尤其是早产儿和低出生体重儿，免疫系统不成熟且胃肠道通透性高，极易发生严重食源性感染。
PIF并非无菌产品，易受内源性和获得性微生物污染。肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）被列为A类危害，具有强流行病学和微生物学证据关联PIF介导的暴发。大肠杆菌（Escherichia coli）属于B类危害，可能引起败血症等全身性感染。重大挑战在于，即使低于标准检测方法阈值的低水平污染，在奶粉复水和细菌增殖后也可能引发大规模暴发。
为降低风险，世界卫生组织（WHO）建议0–6个月婴儿PIF使用不低于70 °C的水复水以灭活病原体营养细胞。然而研究表明，极高比例的父母/照护者未遵循建议，常使用较低温度的水或未遵循正确卫生和灭菌规程。约84.1%的家用配方制备机和21.7%的水壶未能达到WHO推荐的70 °C。高达73%的照护者在制备前不洗手，30%不阅读安全说明，84%的父母依赖个人经验而非官方指南。同时，高温可能降解热敏感营养素或降低添加益生菌的活力。在此背景下，添加益生菌被提出作为抑制病原体黏附和定植的策略，通过竞争和产生抗菌代谢物形成生物屏障，在配方以次优温度复水或照护者未遵循推荐规程时限制病原体增殖。
二、研究内容与结论
本研究评估了两种益生菌菌株——鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）HN001和长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）IM-1——在模拟低水平污染场景下抑制肠道沙门氏菌和大肠杆菌增殖的能力。研究在复水配方奶粉中，以1或10 CFU/10 g的低接种水平挑战病原体，在厌氧条件下37 °C孵育18小时。结果表明，在无益生菌条件下，两种病原体相对丰度显著增加，达到22.2–98.3%的群落占比；而益生菌补充条件下，病原体在大多数条件下检测不到或降至<1%，同时乳酪杆菌属和乳杆菌属成为优势菌群，占群落的82.8–99.7%。研究结论认为，IM-1和HN001的组合在低水平污染条件下对大肠杆菌和肠道沙门氏菌发挥稳健的抑制效应，可能为复水PIF提供额外的病原体限制屏障，在家庭制备错误场景下（益生菌在约60 °C以下仍存活而病原体可能增殖）提供额外安全层，但益生菌不能替代以70 °C水制备配方奶粉的要求。
三、关键技术方法
研究采用以下主要技术方法：益生菌菌株在MRS肉汤中厌氧培养制备，病原菌在营养肉汤中有氧培养制备，通过比浊仪调整菌液浓度。模拟污染试验中，将益生菌以107 CFU/mL加入复水PIF，病原体以1或10 CFU/10 g加入，设置7个实验组，在厌氧工作站中37 °C孵育18小时，于T0h和T18h采样。微生物组成分析采用下一代测序（NGS）靶向细菌16S rRNA基因V4区，使用基于515F-806引物对的Tag-Fusion引物进行PCR扩增，在GeneStudio S5系统上测序，数据使用QIIME2处理，DADA2去噪生成扩增子序列变体（ASVs），基于SILVA数据库进行朴素贝叶斯分类器分类学分配，计算属水平相对丰度。共分析112个样本，大肠杆菌挑战进行4次独立实验（E1、E2、E3、E6），肠道沙门氏菌挑战进行4次独立实验（E1、E2、E4、E5）。
四、研究结果
3.1 低接种水平大肠杆菌挑战试验
在无益生菌的C1和C10条件下，大肠杆菌（Escherichia）相对丰度在T0h至T18h间显著增加，T18h时分别占细菌群落的22.2–96.9%和16.2–98.3%。益生菌补充条件下（1和10），大肠杆菌相对丰度在T18h显著低于T0h（1 CFU/10 g条件：n=8，Wilcoxon符号秩检验p=0.0156；10 CFU/10 g条件：n=8，p=0.0078），T18h时大肠杆菌未被16S测序流程检出或保持极低相对丰度。群落组成分析显示，C1和C10中大肠杆菌增加伴随从以Bacillota_I和肠球菌科（Enterococcaceae）为主的群落向高比例假单胞菌门（Pseudomonadota）和大肠杆菌的转变；益生菌补充样本在T18h以乳酪杆菌属和乳杆菌属为主，两属合计占群落82.8–99.7%。
3.2 低接种水平肠道沙门氏菌挑战试验
在无益生菌的C1和C10条件下，沙门氏菌（Salmonella）相对丰度在T0h至T18h间显著增加，T18h时分别达到细菌群落的37.2–97.0%和93.7–98.3%。益生菌补充条件下，沙门氏菌在T0h检出低相对丰度，T18h在可评估样本中保持极低相对丰度。A和B独立重复制备联合分析显示，1 CFU/10 g条件下T0h至T18h变化不显著（n=7，p=0.1875），10 CFU/10 g条件下显著降低（n=8，p=0.0078）。群落组成显示，C1和C10中沙门氏菌增加伴随初始优势的Bacillota_I类群（尤其肠球菌科）相对代表度显著降低；益生菌补充样本在T18h以乳酪杆菌属和乳杆菌属为主，两属合计占91.9–99.1%，双歧杆菌属（Bifidobacterium）占较小组分（0.3–7.1%）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，无益生菌配方中病原体显著增长符合预期，因为实验条件本身有利于增殖更快的病原体，属于严格模型，不应解释为典型消费者制备或储存实践。益生菌补充配方中病原体显著降低，归因于营养竞争和抗菌活性两种机制。IM-1和HN001此前研究已显示对大肠杆菌和肠道沙门氏菌的抗菌活性，IM-1在共培养实验中可置换肠上皮细胞层上的某些病原体，其无细胞上清液对大肠杆菌诱导的细胞毒性具有保护作用。HN001在婴儿临床研究中显示安全性，并具有针对多种胃肠道病原体的抗菌活性。研究强调，益生菌的添加不替代适当的配方制备实践，但可在家庭制备常见错误发生时提供额外安全边际。研究在受控实验条件下进行，属于体外模型，发现不应解释为产品安全性改善、感染风险降低或临床保护的证据，需进一步工业规模验证和体内评估。
结论部分翻译：总之，IM-1和HN001的益生菌组合通过限制大肠杆菌和肠道沙门氏菌在低水平污染婴儿配方奶粉中的增殖发挥稳健的抑制效应，可能为复水PIF提供额外的病原体限制屏障。虽然益生菌不替代以70 °C水制备配方奶粉的需要，但在家庭制备错误情况下（益生菌在约60 °C以下仍存活而病原体可能增殖）可提供额外安全层。这些菌株的掺入可能通过促进婴儿营养产品的微生物稳定性和质量产生积极公共卫生影响，尤其在次优制备实践高发地区，但如前所述，不替代以70 °C水制备配方奶粉的要求。
