《Nutrients》：Ultra-Processed Foods in Early Life: Biological Mechanisms, Developmental Programming and Childhood Obesity—A Narrative Review
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目的：利用母体肥胖小鼠模型，鉴定肥胖母鼠与瘦弱母鼠子代之间的差异甲基化基因。背景：胎儿发育期间的不良环境使子代易患成人疾病，支持胎儿编程理论。DNA甲基化被认为是母体肥胖诱导胎儿编程的机制之一。鉴于母体肥胖使子代易患慢性肾脏病（CKD），本研究旨在探讨DNA甲
目的：利用母体肥胖小鼠模型，鉴定肥胖母鼠与瘦弱母鼠子代之间的差异甲基化基因。背景：胎儿发育期间的不良环境使子代易患成人疾病，支持胎儿编程理论。DNA甲基化被认为是母体肥胖诱导胎儿编程的机制之一。鉴于母体肥胖使子代易患慢性肾脏病（CKD），本研究旨在探讨DNA甲基化在母体肥胖相关子代CKD中的作用。方法：通过给雌性C57BL/6小鼠在繁殖前、妊娠期及哺乳期喂食高脂饮食建立母体肥胖模型，对照组母鼠喂食标准饲料。雄性后代于出生后第20天断奶并转喂标准饲料，于32周龄（成年期）处死；另有一组子代于出生时处死。采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）鉴定成年期及出生时子代肾脏和血液中的差异甲基化基因（DMG），并用实时荧光定量PCR检测基因表达。结果：肥胖母鼠的成年子代在肾脏和血液中均表现出显著的DMG，同时伴有肾损伤加重。其中，10个基因在肾脏中差异甲基化，其中4个基因在血液中也差异甲基化；另有10个基因仅在血液中差异甲基化。肾脏中Rcsd1、Cdk8、Taco1和Axin2四个基因的mRNA表达显著上调，证实这些基因因表观遗传调控而发生了转录改变。通路分析显示Wnt经典信号通路相关基因显著富集。相比之下，出生第1天未检测到显著DMG。结论：母体肥胖诱导成年子代肾脏和血液中发生差异基因甲基化，其中多个基因与肾纤维化、糖尿病或肥胖高度相关，支持表观遗传调控在母体肥胖编程子代CKD中的作用。
一、研究背景与目的
慢性肾脏病（CKD）是全球重要的公共卫生问题，其发生发展受遗传与环境因素共同影响。近年来，胎儿编程理论认为，宫内不良暴露可使胎儿在成年后更易罹患慢性疾病。母体肥胖已被证实是子代成年后发生CKD的显著危险因素。此前研究团队利用母体肥胖啮齿动物模型发现，妊娠期暴露于母体肥胖的子代在成年期会出现白蛋白尿、肾小球硬化、肾纤维化，以及肾脏氧化应激和炎症水平升高。
DNA甲基化是研究最深入的表观遗传修饰形式，可在不改变DNA序列的前提下调控基因表达，并可能响应饮食、运动、药物、毒素及感染等环境应激。由于哺乳动物体内大部分DNA甲基化发生在宫内发育关键期，因此DNA甲基化被认为是胎儿编程成人慢性疾病的重要机制。动物和人类研究均已发现肥胖母亲与瘦弱母亲子代之间存在DNA甲基化水平差异，例如母体肥胖可导致子代肝脏中Irs2基因高甲基化及Map2k4基因低甲基化，与成年后糖尿病易感性相关；人类研究也发现母体肥胖可增加胎盘胎儿侧瘦素启动子甲基化，并在新生儿脐血白细胞及青春期外周血中鉴定出多个差异甲基化位点。
然而，母体肥胖对子代肾脏DNA甲基化的影响此前鲜有报道。研究团队前期工作已发现母体肥胖可上调子代32周龄肾脏整体DNA甲基化水平，且DNA甲基化已被证实与CKD多个方面相关，包括CKD患者与对照者之间肾脏和血液的差异甲基化基因，以及快速进展性CKD与稳定CKD患者全血甲基化模式的差异。基于此，研究人员提出假说：母体肥胖引起的子代肾脏DNA甲基化改变可能与成年期CKD发生相关。本研究利用母体肥胖小鼠模型，旨在鉴定肥胖母鼠与对照母鼠成年子代之间的差异甲基化基因，并分析出生时子代的甲基化状态，同时对这些基因进行与CKD及代谢性疾病相关性的事后分析，验证差异甲基化模式所导致的基因表达改变。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员采用8周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为高脂饮食组（HFD，43%能量来自脂肪）和标准饮食组，自繁殖前持续至妊娠期和哺乳期。雄性后代于出生后第20天断奶并转喂标准饮食。实验设置两个后代组：对照组后代（CC）和母体肥胖暴露后代（HC）。出生第1天子代部分处死取材，其余于32周龄成年期处死。每组样本量：第1天4只/组，32周龄7–8只/组，其中3只用于DNA甲基化分析。主要技术方法包括：采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）鉴定肾脏和血液中的差异甲基化基因；利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）验证基因mRNA表达；通过尿白蛋白/肌酐比（UACR）评估肾功能；采用PAS染色和天狼星红染色进行肾组织病理评分；运用基因本体（GO）和KEGG通路富集分析解析差异甲基化基因的生物学功能。
三、研究结果
3.1 母体高脂饮食诱导子代肾损伤
32周龄时，高脂饮食母鼠所生雄性后代体重无明显变化，但肾脏重量与体重比值显著增加（p<0.01），尿白蛋白肌酐比显著升高（p<0.05），同时肾小球硬化指数和肾小管间质损伤复合指数均显著增加（p<0.05），表明母体肥胖导致子代成年期出现CKD相关病理改变。
3.2 32周龄肾脏差异甲基化基因
在肾脏中，共鉴定出10个显著差异甲基化基因。其中3个基因高甲基化，包括2810004N23Rik、Rnf150和Cdon；7个基因低甲基化，包括Rcsd1、Cdk8、Pex2、Taco1、Axin2、1700030C10Rik和Gm20110。Axin2具有最多的差异甲基化位点（9个），其次为Cdk8和Pex2（各8个）。
3.3 32周龄血液差异甲基化基因
在血液中，共鉴定出14个显著差异甲基化基因。8个基因高甲基化：2810004N23Rik、Arhgef26、Ets1、Cdk8、Gm28590、Cylc1、H2-Q6和Tmtc2；6个基因低甲基化：Rcsd1、Pex2、Pcdh7、SOCS3、B230209E15Rik和A630010A05Rik。肾脏和血液共有4个共同差异甲基化基因：Rcsd1、Cdk8、Pex2和2810004N23Rik，其中Rcsd1、Pex2和2810004N23Rik在两种组织中甲基化方向一致。
3.4 仅肾脏差异甲基化基因的mRNA表达
肥胖母鼠后代肾脏中Taco1和Axin2的mRNA表达显著高于对照组（p<0.05），而Rnf150、1700030C10Rik、Gm20110和Cdon的表达在两组间无显著差异。
3.5 肾脏与血液共同差异甲基化基因的mRNA表达
肥胖母鼠后代肾脏中Rcsd1和Cdk8的mRNA表达显著升高（p<0.05），Pex2表达有升高趋势但未达统计学显著（p=0.12），2810004N23Rik表达无组间差异。
3.6 32周龄通路分析
肾脏差异甲基化基因显著富集于Wnt信号调控相关通路；血液中显著富集炎症反应和脂质代谢相关通路；肾脏和血液共同富集过氧化物酶体调控通路。KEGG分析显示肾脏中Wnt信号和过氧化物酶体通路富集，血液中1型和2型糖尿病相关通路显著。
3.7 出生第1天与32周龄甲基化比较
出生第1天肾脏和血液均无显著差异甲基化基因（FDR>0.05），但32周龄显著差异甲基化基因中，Axin2、Cdk8、Pex2、1700030C10Rik、Rcsd1和Gm20110在出生第1天已呈现相同方向的低甲基化趋势；血液中Cdk8、Arhgef26、Gm28590、Tmtc2、2810004N23Rik、H2-Q6、Cylc1和Ets1在出生第1天也呈现与32周龄一致的高甲基化趋势，SOCS3呈现低甲基化趋势。
3.8 出生第1天通路分析
出生第1天肾脏差异甲基化基因富集于肾发育相关通路，包括肾小管形成、中肾小管/上皮发育、输尿管芽发育、肾脏/泌尿系统发育及肾上皮发育；血液中富集主动脉瓣形态发生、心瓣膜形态发生、树突形态发生、VEGF信号及脂质代谢通路。KEGG分析显示肾脏中Wnt信号通路富集，与32周龄结果一致。
四、讨论与结论
讨论部分指出，母体肥胖诱导的子代DNA甲基化改变在成年期肾脏和血液中显著存在，且与肾损伤水平相关。Wnt信号通路相关基因在出生第1天和32周龄均显著富集，提示该表观遗传特征可能从早期持续至成年期，参与CKD的编程。Axin2作为Wnt通路的负反馈调节因子，其低甲基化和高表达可能抑制肾损伤后的组织修复，导致适应不良性修复。Cdk8在肾脏中低甲基化并伴随表达上调，可能通过激活Notch信号通路促进肾纤维化。Taco1、Rcsd1和Pex2的低甲基化及表达上调分别涉及线粒体呼吸、肌动蛋白结合和过氧化物酶体生物合成，其中Pex2上调与氧化应激标志物增加一致。部分差异甲基化位点位于非编码区，其甲基化改变未引起转录表达变化，其意义尚不明确。研究局限性包括样本量较小、组织为多细胞混合体可能对甲基化结果产生混杂影响，未来需扩大样本量并采用基因敲除模型及细胞去卷积分析进一步验证。
结论部分指出，对小鼠肾脏和血液样本的分析揭示了母体肥胖暴露子代在成年期存在高度显著的基因甲基化差异，且与Wnt信号通路相关。母体肥胖诱导的子代肾脏DNA甲基化改变此前未见报道。文献回顾显示，多个差异甲基化基因与CKD、纤维化、糖尿病、肥胖和脂质代谢高度相关，支持表观遗传调控参与母体肥胖编程子代CKD的假说。未来需在更大队列和人类组织中进一步验证该机制。
