缺血性卒中中牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）神经保护效力的再评估：一项多模型体内外研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Reassessment of Neuroprotective Efficacy of TUDCA in Ischemic Stroke: A Multi-Model In Vivo and In Vitro Study

　　

摘要：缺血性卒中占所有卒中的87%，仍是全球死亡率和发病率的主要原因之一，然而治疗选择仍然有限。关于肠-脑轴及微生物代谢产物作为卒中结局调节因子的新证据，已将牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），一种牛磺酸结合型次级胆汁酸，定位为候选神经保护剂。在本研究中，研究人员评估了静脉注射TUDCA（100 mg/kg）在经历短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）或永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）的雄性C57BL/6小鼠中的作用，给药时间分别为卒中诱导前或后一小时。梗死体积、神经功能评分和免疫球蛋白G（IgG）外渗作为主要结局指标，并使用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的血脑屏障（BBB）器官芯片系统进一步评估BBB完整性。TUDCA在两种体内模型中均未显著减少梗死体积、改善神经功能结局或减轻BBB渗漏，在常氧或缺氧条件下，也未能在体外实验中维持屏障通透性或ZO-1表达。这些发现表明，在所测试的条件下，TUDCA不影响缺血性脑损伤的发展或BBB完整性的特征，并且需要进一步优化剂量和给药策略才能全面评估其在缺血性卒中中的治疗潜力。

缺血性卒中中牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）神经保护效力的多模型再评估解读

一、研究背景与科学问题

缺血性卒中约占所有卒中的87%，是全球致残和致死的主要病因之一，但目前有效的神经保护疗法仍十分匮乏。近年来，肠-脑轴及其微生物代谢产物对卒中结局的调控作用受到广泛关注。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）作为一种牛磺酸结合的次级胆汁酸，因其能够穿越血脑屏障（BBB）且毒性较低，在阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病中展现出治疗潜力。既往在大鼠缺血性和出血性卒中模型中，TUDCA在特定剂量下（64–400 mg/kg）可减少约30–50%的梗死体积。然而，这些效应在小鼠模型中是否可重复尚未明确，且TUDCA对BBB完整性的系统性影响缺乏深入研究。此外，不同卒中模型（如再灌注与非再灌注）下的疗效一致性也亟待验证。因此，本研究旨在通过多模型体系，系统评估TUDCA在缺血性卒中中的神经保护作用及其对BBB完整性的影响。

二、主要技术方法

1. 1.
   体内卒中模型：采用雄性C57BL/6J小鼠，分别建立短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型（模拟缺血再灌注损伤）和永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）模型（模拟持续缺血）。TUDCA（100 mg/kg）或PBS于卒中诱导前1小时（预防性）或后1小时（治疗性）经尾静脉单次注射。
2. 2.
   BBB完整性评估：通过免疫荧光标记内源性IgG外渗定量评估BBB通透性；利用人诱导多能干细胞（iPSC）分化的脑微血管内皮细胞（iBMECs）与人原代星形胶质细胞、周细胞共培养，构建双通道微流控BBB器官芯片模型，测定10 kDa FITC-右旋糖酐的表观渗透系数（P_app）。
3. 3.
   缺氧处理与紧密连接蛋白分析：iBMECs暴露于5% O₂的缺氧环境（24、48或72小时），TUDCA在缺氧前或后给予，通过免疫荧光染色量化紧密连接蛋白ZO-1的表达变化。

三、研究结果

2.1 卒中前给予TUDCA不改变梗死体积或减轻BBB破坏

在tMCAO模型中，术前单次静脉注射TUDCA（100 mg/kg）未能显著减小梗死体积，且梗死区域在头尾向分布及各脑区（皮层、纹状体等）均无差异。28分神经功能评分显示两组动物均呈现自发恢复，但组间无统计学差异。在dMCAO模型中，TUDCA预处理组梗死体积虽有下降趋势，但未达显著性。IgG外渗检测显示，tMCAO术后两组BBB渗漏比例无差异；dMCAO模型中TUDCA组IgG染色强度虽降低，但同样无统计意义。

2.2 卒中后给予TUDCA不能显著缩小梗死体积或减轻BBB渗漏

在tMCAO模型中，卒中后1小时给予TUDCA未能减少梗死体积，神经功能评分亦无改善。dMCAO模型中，TUDCA后处理组梗死体积呈微小但一致的下降趋势，但未达到统计学显著性。IgG外渗方面，tMCAO模型两组无差异；dMCAO模型中TUDCA组IgG信号反而呈非显著增加。

2.3 TUDCA不影响基于人细胞的BBB芯片通透性

iBMECs成功分化并表达ZO-1、occludin、claudin-5及CD31。MTT实验证实1–50 μg/mL TUDCA对iBMECs无细胞毒性。在BBB芯片中，TUDCA处理后P_app值呈下降趋势（提示屏障完整性改善），但与未处理芯片相比无统计学差异，且在撤药后24小时仍保持该趋势但无显著性。

2.4 TUDCA不影响缺氧条件下iBMECs的ZO-1表达

在未加TUDCA的对照组中，24小时缺氧导致ZO-1荧光强度最大幅度下降，48小时下降幅度减小，72小时无明显变化。无论TUDCA在缺氧前还是缺氧后给予，各缺氧时长组内的ZO-1表达均无显著差异。跨缺氧条件比较显示，TUDCA预处理和后处理均未改变ZO-1表达水平。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是：在严格的随机化、盲法设计下，无论是预防性还是治疗性给药，静脉注射TUDCA（100 mg/kg）均未能在小鼠tMCAO和dMCAO模型中显著减少梗死体积、改善神经功能或减轻BBB渗漏。体外BBB芯片及iBMECs缺氧模型同样未观察到TUDCA对屏障功能或紧密连接的明显保护作用。这一阴性结果与早期大鼠模型中的阳性报道形成对比，提示TUDCA的神经保护效应可能具有物种依赖性。既往在大鼠中有效的剂量（64–400 mg/kg）和给药时机（缺血后1–2小时）在本小鼠模型中未能重现，而小鼠中长期给药（如APP/PS1模型中每3天500 mg/kg腹腔注射持续3个月）方显现效果，表明急性单次给药方案可能不足以在小鼠中产生生物学活性。此外，肌萎缩侧索硬化症III期临床试验（TUDCA-ALS, NCT03800524）同样未显示TUDCA延缓疾病进展的疗效，进一步支持其治疗潜力的情境依赖性。

研究结论：在所测试的条件下，TUDCA不影响缺血性脑损伤的发展或BBB完整性的特征，需要进一步优化剂量和给药策略才能全面评估其在缺血性卒中中的治疗潜力。