胰腺癌恶病质促进微环境的空间演化：SEMA4A+肿瘤细胞、AQP9+巨噬细胞与LOXL2+癌相关成纤维细胞构成的三细胞生态位驱动系统性消耗

《Cell》：Spatial evolution of a cachexia-promoting microenvironment in pancreatic cancer

　　

恶病质（cachexia）是胰腺癌（pancreatic cancer，PC）发病和死亡的主要原因，但连接肿瘤进展与全身性消耗的细胞回路仍未完全阐明。研究人员整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、Xenium空间转录组学（Xenium spatial transcriptomics）、多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry，mIHC）、批量转录组学（bulk transcriptomics）以及跨人类非恶病质、前恶病质和恶病质样本的功能研究，并结合小鼠模型，定义了一个由SEMA4A⁺肿瘤细胞、AQP9⁺巨噬细胞和LOXL2⁺癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）组成的恶病质相关微环境生态位。机制上，SEMA4A相关信号促进骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）依赖的AQP9相关巨噬细胞表型获得，而巨噬细胞来源的C-X-C基序趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）激活LOXL2⁺成纤维细胞。LOXL2⁺成纤维细胞通过外泌体N-糖基化LOXL2反向增强肿瘤细胞FOSL1/SEMA4A信号。空间分析表明，该生态位随恶病质严重程度进行性富集，并与既往非恶病质患者术后恶病质发生相关。这些发现提供了连接局部肿瘤生态系统动态与恶病质进展的框架。

【研究背景与问题】胰腺癌（PC）预计到2030年成为癌症相关死亡的第二大原因，仍是致死性最高的实体恶性肿瘤之一，各分期5年相对生存率低于13%。超过80%的PC患者发生恶病质（cachexia，CAC），其表现为进行性体重下降、骨骼肌消耗和脂肪组织耗竭，由系统性炎症、代谢紊乱和严重厌食驱动。CAC可分为前恶病质（pre-CAC）、恶病质（CAC）和难治性恶病质。前CAC是最早可临床识别的阶段，以系统性代谢和内分泌改变及早期肌肉丢失为标志，甚至无明显体重下降。临床前研究提示，在该阶段干预可延缓CAC进展。然而，由于缺乏共识生物标志物和标准化诊断标准，CAC在明显肌肉消耗或炎症出现前常被漏诊。CAC源于肿瘤内在程序与宿主系统性反应之间的复杂互作。在PC中，致癌KRAS信号驱动代谢重编程，重塑营养利用和宿主-肿瘤代谢串扰；ACSS2-ZIP4-TRAIL轴将肿瘤代谢应激与肌肉蛋白水解偶联，肿瘤来源细胞因子、生长因子和外泌体激活骨骼肌分解代谢通路。除肿瘤来源可溶性因子外，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）通过恶性细胞、免疫细胞、基质细胞和神经细胞间互作关键性调控CAC。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）通过与肿瘤细胞互作促进肌肉消耗，肿瘤-免疫-神经互作，包括GDF15-β肾上腺素能信号轴，驱动CAC和厌食。但多数机制研究聚焦晚期CAC，早期CAC启动及前CAC向CAC转变的时空动态仍不清楚。因此，研究人员开展整合多组学研究，以解析PC CAC的分子机制和时空动态。该论文发表于《Cell》。

【关键技术方法】研究人员整合scRNA-seq（10x Genomics）、高分辨率Xenium空间转录组学（5K assay）、mIHC、批量转录组学（RNA-seq）和功能研究，覆盖人类非CAC、前CAC和CAC样本及小鼠模型。患者样本来自北京医院和National Cancer Center/Cancer Hospital，2019年12月至2026年1月，共纳入227例治疗初治PC患者，采集肿瘤、腹直肌骨骼肌和血浆；scRNA-seq纳入43例新鲜肿瘤样本，Xenium空间分析纳入66例，批量RNA-seq扩展队列132例。实验使用KPC、AsPC-1、C2C12、THP-1细胞，原代huCAF、muCAF和TAMs，原位小鼠模型，并结合流式细胞术、ELISA、蛋白质印迹、CUT&Tag-qPCR、双荧光素酶报告基因和条件培养基等功能验证。

【研究结果】
单细胞图谱揭示CAC进展期间PC微环境：研究人员对43例非CAC、前CAC和CAC患者肿瘤进行scRNA-seq，获得307,753个高质量细胞，鉴定12个主要细胞群体。CAC阶段TME组成差异明显，CAFs是主要基质群体并在恶病质样本中更丰富。L3 psoas muscle index（L3 PMI）与血红蛋白和握力正相关、与C反应蛋白负相关；CAF丰度与L3 PMI负相关，提示基质重塑与骨骼肌耗竭相关。

SEMA4A⁺肿瘤细胞驱动PC CAC的鉴定：研究人员通过非负矩阵分解（NMF）定义肿瘤元程序，将肿瘤细胞分为SEMA4A⁺、S100A2⁺、REG4⁺、PLCG2⁺和EMP3⁺亚群。SEMA4A⁺肿瘤细胞在恶病质样本中富集，EMP3⁺减少；扩展队列GSVA验证SEMA4A⁺特征评分在CAC组升高，且与体重下降严重程度正相关。GSEA显示炎症和NF-κB信号富集。血浆SEMA4A在恶病质患者升高，并与SEMA4A⁺肿瘤细胞丰度正相关。功能上，SEMA4A⁺ KPC肿瘤小鼠虽肿瘤负荷相当，但肌肉消耗更严重；重组人SEMA4A诱导C2C12肌管萎缩标志物，抑制SEMA4A可减轻CAC相关肌肉消耗。

FOSL1/SEMA4A轴通过肌肉中NRP1-Akt-MuRF1信号通路驱动PC CAC：扩散映射显示PLCG2⁺为根状态，可分化为SEMA4A⁺和EMP3⁺谱系。转录因子预测和pySCENIC分析优先识别FOSL1，其在SEMA4A⁺发育谱系中与SEMA4A协同诱导；FOSL1敲低降低SEMA4A表达和转录活性，CUT&Tag证实FOSL1结合SEMA4A启动子。FOSL1缺失削弱PC细胞诱导肌管萎缩的能力。重组SEMA4A降低Akt磷酸化并增加MuRF1和Atrogin-1；敲低NRP1消除肿瘤细胞的萎缩效应，表明FOSL1/SEMA4A通过NRP1-Akt-MuRF1轴启动PC CAC。

CAFs促进肌肉萎缩和PC CAC：scRNA-seq显示恶病质样本CAF丰度增加，批量RNA-seq GSVA验证CAF相关转录特征升高并与体重下降严重程度正相关。恶病质肌肉组织呈现I型肌纤维特征增加、II型肌纤维特征减少，脂肪细胞和成纤维细胞相关特征升高；配对肿瘤-肌肉分析显示肿瘤CAF丰度与肌肉内纤维化正相关。从恶病质患者和小鼠分离的huCAFs和muCAFs增强肿瘤相关肌肉消耗。CAF来源信号增加肿瘤细胞FOSL1和SEMA4A表达；肿瘤细胞SEMA4A敲低后，CAF促CAC效应大部分消失，提示CAF通过FOSL1/SEMA4A轴驱动肌肉消耗。

LOXL2⁺ CAFs定义PC中促进CAC的CAF亚群：研究人员解析8个CAF亚簇并归为4种CAF状态，发现LOXL2⁺ CAF在恶病质样本中增加，批量GSVA与体重下降严重程度正相关，IHC显示肌成纤维性LOXL2⁺ CAF在恶病质PC组织积累，并与肌肉纤维化负担正相关。轨迹分析提示PDGFC⁺ CAF为LOXL2⁺ CAF潜在前体；LOXL2⁺ CAF富集糖蛋白代谢和N-糖聚糖生物合成通路。重组人LOXL2增加PC细胞FOSL1和SEMA4A表达，其条件培养基增强C2C12肌管Akt/MuRF1相关萎缩通路。LOXL2基因缺失或药物抑制降低CAF激活肿瘤FOSL1/SEMA4A能力，并在体内减轻肌肉消耗。LOXL2富集于CAF条件培养基外泌体部分，GW4869抑制外泌体分泌降低CAF诱导的FOSL1/SEMA4A激活；PNGase F和衣霉素实验支持N-糖基化LOXL2经外泌体递送激活肿瘤FOSL1/SEMA4A轴。

AQP9⁺巨噬细胞编程LOXL2⁺ CAF以进一步强化PC CAC：相关网络显示AQP9⁺巨噬细胞与LOXL2⁺ CAF丰度在前CAC和CAC样本中正相关，非CAC中无此关系；细胞通讯分析显示CAC组两者互作更强。AQP9⁺巨噬细胞在恶病质组增加，呈M1极化样，富集炎症通路。恶病质TAMs条件培养基而非非恶病质TAMs条件培养基显著上调huCAFs中LOXL2和αSMA。NicheNet分析提示CXCL8为AQP9⁺巨噬细胞高表达配体之一；重组人CXCL8通过CXCR1/2和JNK/c-Jun通路增加CAF LOXL2表达，CXCR1/2抑制剂Reparixin或JNK抑制剂SP600125可阻断。体内抑制CXCR1/2减轻muCAF与KPC细胞联合模型的肌肉萎缩，表明AQP9⁺巨噬细胞通过CXCL8/CXCR1/2/JNK/c-Jun轴激活LOXL2⁺ CAF。

SEMA4A⁺肿瘤细胞通过BMP2诱导AQP9⁺巨噬细胞：相关网络分析发现SEMA4A⁺肿瘤细胞是与AQP9⁺巨噬细胞相关的主要恶性群体，CAC组两者双向信号增强。NicheNet预测BMP2为驱动AQP9⁺巨噬细胞极化的顶级配体之一，且主要定位于SEMA4A⁺肿瘤细胞。肿瘤细胞条件培养基诱导M0 THP-1巨噬细胞AQP9和CXCL8表达，重组人BMP2同样诱导。cTAMs单独作用有限，但cTAMs预激活的CAF显著诱导PC细胞FOSL1和SEMA4A；巨噬细胞-CAF协同增强肿瘤细胞诱导肌管萎缩的能力，建立SEMA4A⁺肿瘤细胞来源BMP2驱动AQP9⁺巨噬细胞极化，继而激活LOXL2⁺ CAF促进CAC的级联。

肿瘤-巨噬细胞-CAF生态位形成作为PC CAC驱动力：研究人员利用Xenium对66例PC患者肿瘤切片进行空间转录组分析，覆盖非CAC、前CAC和CAC，检测2,500,565个细胞和5,001个基因，鉴定主要细胞类型。以SEMA4A⁺肿瘤细胞为中心进行细胞邻域分析，定义4种空间生态位：生态位1同时含SEMA4A⁺肿瘤细胞、LOXL2⁺ CAF和AQP9⁺巨噬细胞；生态位2仅含AQP9⁺巨噬细胞；生态位3仅含LOXL2⁺ CAF；生态位4无二者。16.8%的SEMA4A⁺肿瘤细胞位于生态位1。生态位1中SEMA4A⁺肿瘤细胞比例与CAC进展相关，其他肿瘤亚型无此变化；生态位1内SEMA4A⁺肿瘤细胞高表达CAC相关、炎症和免疫相关通路。mIHC证实CAC组织中SEMA4A⁺肿瘤细胞、LOXL2⁺ CAF和AQP9⁺巨噬细胞密度增加、三细胞间距缩短。基于生态位1相对非生态位1 SEMA4A⁺肿瘤细胞上调基因构建特征，63例患者随访6个月显示该特征评分与术后体重下降严重程度正相关；38例基线非CAC患者中，29例发生新发CAC者评分高于9例持续非CAC者，提示该特征可能预测术后CAC风险。

【讨论与结论】讨论指出，癌症CAC仍是PC中理解不足的并发症，显著增加发病率和死亡率。通过整合多组学，研究人员识别由SEMA4A⁺肿瘤细胞、LOXL2⁺ CAF和AQP9⁺巨噬细胞组成的致病三元生态位，该生态位自我强化。生态位在前CAC阶段即出现，具有代谢改变和早期肌肉功能障碍特征，在明显体重下降前即存在，并通过层级细胞互作推动向CAC和难治性CAC进展。该时空特异性提示生态位可能是从可逆代谢功能障碍转向不可逆系统性衰退的关键开关。生态位分子特征与基线非CAC患者新发CAC相关，提示早期检测生物标志物潜力；循环SEMA4A、LOXL2⁺ CAF来源外泌体或AQP9⁺巨噬细胞标志物可能支持液体活检。SEMA4A⁺肿瘤细胞在恶病质患者中富集并随小鼠CAC进展增加；SEMA4A除免疫调节功能外，本研究揭示其在PC CAC中先前未被认识的作用，血浆SEMA4A升高提示预测生物标志物潜力。LOXL2⁺ CAF为αSMA升高、糖代谢增强的肌成纤维细胞亚群，通过外泌体N-糖基化LOXL2促进肿瘤细胞向SEMA4A高表型转变；非特异性CAF清除可能反常加速PC进展，因此支持亚型特异性靶向LOXL2⁺ CAF。研究发现AQP9⁺巨噬细胞在CAC中晚期小鼠肿瘤中富集，呈炎症M1样表型；恶病质患者TAMs具有更强AQP9⁺巨噬细胞特征并能激活CAF。讨论也指出，SEMA4A-AQP9-LOXL2信号回路是主要CAC相关轴，但PC CAC是多因素综合征，SEMA4A抑制后残余肌肉消耗提示其他CAF来源因子和免疫信号通路也参与。临床意义上，当前CAC诊断依赖晚期体重下降，错过前CAC干预窗口；该生态位为早期拦截提供框架。研究局限包括：其他肿瘤细胞群和既往报道的CAC相关介质如IL-6、IGFBP2、HSPA9、S100A8、S100A9、IL-8和RAB27B可能协同SEMA4A促进CAC；循环SEMA4A未区分非CAC与前CAC，早期生物标志物价值需大队列前瞻验证；GSVA估计相对富集而非直接细胞丰度；生态位特征虽与术后CAC相关，但临床实施前需独立大队列前瞻验证。

研究结论翻译：综合而言，研究结果支持一个模型，即生态位1内的SEMA4A⁺肿瘤细胞驱动AQP9⁺巨噬细胞逐步极化和LOXL2⁺ CAF激活。激活的LOXL2⁺ CAF反过来分泌升高的N-糖基化LOXL2，进一步放大SEMA4A⁺肿瘤细胞活性，建立自我强化的三细胞互作，关键性促进肌肉萎缩和CAC。