《International Journal of Molecular Sciences》：Ciprofloxacin-Induced Oxidative Stress Promotes a Senescence-like Phenotype in Human Fibroblasts In Vitro
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氟喹诺酮类（fluoroquinolones）是有效的合成广谱抗生素，但其使用可能与持续性不良反应相关，有时被描述为氟喹诺酮诱导的失能（fluoroquinolone-induced disability）。尽管越来越多的证据提示线粒体功能障碍、
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氟喹诺酮类（fluoroquinolones）是有效的合成广谱抗生素，但其使用可能与持续性不良反应相关，有时被描述为氟喹诺酮诱导的失能（fluoroquinolone-induced disability）。尽管越来越多的证据提示线粒体功能障碍、氧化应激（oxidative stress）和DNA损伤参与其中，但这些效应背后的分子机制仍未完全阐明。研究人员假设这些应激反应的汇聚可能促进细胞衰老（cellular senescence），从而参与氟喹诺酮相关的持续性不良反应。研究人员在体外原代人成纤维细胞中检测了三种临床使用的氟喹诺酮类药物——环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、莫西沙星（moxifloxacin，MOX）和左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）。为期7天的暴露显示，200 μM环丙沙星（而非200 μM莫西沙星或500 μM左氧氟沙星）诱导了衰老样表型，其特征为衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）活性升高以及衰老指数（senescence index，SI）增加，该指数通过成像流式细胞术整合了细胞大小和自发荧光的增加。在第7天，环丙沙星在转录水平或分泌水平均未诱导广泛的经典衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），提示其处于非经典衰老样状态；仅在14天后出现IL-1β分泌的适度增加。环丙沙星诱导的表型并未伴随经典p53、p16或p21蛋白标志物的显著升高，但与视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，RB）Ser795位点磷酸化降低相关。然而，在孵育1或2周后从培养基中去除环丙沙星，可在3周实验期结束时使刃天青（resazurin）信号恢复至接近对照值。环丙沙星还增加了氧化应激，这一点通过二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）和二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）评估得以证实。抗氧化剂Trolox和线粒体靶向抗氧化剂SkQ3均减弱了环丙沙星诱导的SA-β-Gal活性和SI的增加。这些发现将氧化应激确定为人成纤维细胞中环丙沙星诱导的衰老样重塑的推定介质，并支持进一步研究药物诱导的细胞衰老作为氟喹诺酮相关持续性不良反应潜在贡献因素的可能性。
论文解读
一、研究背景与研究目的
氟喹诺酮类（fluoroquinolones）药物是一类合成的广谱抗菌药物，通过抑制细菌DNA旋转酶（DNA gyrase）和拓扑异构酶IV（topoisomerase IV）发挥抗菌作用。尽管临床疗效确切，但其系统性使用受到安全性问题的制约，已报道的不良反应包括肌腱病和肌腱断裂、肌肉骨骼疼痛、肌无力、周围神经病变、胃肠道症状及神经精神表现。部分患者在氟喹诺酮暴露后出现持续性或延迟性症状，这一状况有时被称为氟喹诺酮诱导的失能（fluoroquinolone-induced disability）。
实验证据表明，线粒体功能障碍和氧化应激是氟喹诺酮在细胞水平毒性的主要组成部分。线粒体因其细菌进化起源及含有线粒体拓扑异构酶，可能对氟喹诺酮类药物尤为敏感。环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、莫西沙星（moxifloxacin，MOX）和左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）均被报道可诱导细胞死亡、增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）并升高氧化应激标志物水平。抗氧化剂（包括维生素C、维生素E、N-乙酰半胱氨酸及线粒体靶向抗氧化剂MitoQ）可减轻氟喹诺酮诱导的ROS积累、线粒体功能障碍、脂质过氧化和细胞死亡。然而，氟喹诺酮诱导的氧化应激所激活的下游细胞程序仍未得到充分表征。
持续性线粒体功能障碍和氧化应激可促进细胞衰老（cellular senescence）。细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，伴随细胞形态、代谢、基因表达和分泌活性的广泛改变，常见特征包括SA-β-Gal活性升高、细胞形态增大、溶酶体质量增加、自发荧光改变、p53/p21和/或p16/RB通路的激活，以及在许多情境下发展出以炎症细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶释放为特征的异质性衰老相关分泌表型（SASP）。氟喹诺酮类药物对细胞衰老的影响此前了解甚少。既往研究曾报道环丙沙星在特定实验系统中的衰老相关效应，包括胶质母细胞瘤细胞，以及近期在小鼠模型中环丙沙星诱导的胎盘衰老。然而，长期氟喹诺酮暴露是否能在原代人成纤维细胞中诱导衰老样表型、这一反应是否为临床常用氟喹诺酮的普遍特性、以及氧化还原调节干预能否减轻该表型，此前均不清楚。
本研究旨在探讨三种临床使用的氟喹诺酮类药物——环丙沙星、莫西沙星和左氧氟沙星——对人成纤维细胞体外细胞衰老的影响。研究人员采用长期暴露模拟细胞应激，评估了SA-β-Gal活性、细胞大小和自发荧光、SASP相关基因表达和细胞因子分泌、DNA损伤反应及氧化应激，并测试了常规抗氧化剂和线粒体靶向抗氧化剂能否减轻氟喹诺酮诱导的衰老样变化。
二、主要关键技术方法
研究人员使用原代人皮肤成纤维细胞（来自3名28–35岁健康男性供体，来源于莫斯科医学遗传学研究中心生物样本库）、人内皮细胞系EA.hy926（ATCC CRL-2922）和大鼠H9c2心肌母细胞（EcACC 88092904）作为实验模型。主要技术方法包括：SA-β-Gal组织化学染色结合Hoechst核染色及ImageJ定量分析；刃天青（Alamar Blue）还原法检测细胞活力；Amnis FlowSight成像流式细胞术测量衰老指数（SI）、溶酶体质量及氧化应激探针（DHE、DCFH-DA、MitoCLox）荧光信号；Western免疫印迹检测p53、p16、p21及RB Ser795磷酸化水平；RT-qPCR定量分析细胞周期调控、应激反应及细胞因子相关基因表达；γH2AX免疫细胞化学染色评估DNA损伤反应；ELISA检测培养上清中IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平。
三、研究结果
3.1 环丙沙星在体外诱导人成纤维细胞衰老样表型
研究人员选用200 μM CIP、200 μM MOX和500 μM LEV处理人成纤维细胞7天。结果显示，CIP（而非MOX或LEV）显著增加了每细胞的SA-β-Gal活性、衰老指数（SI）和溶酶体含量。MOX和LEV仅使相对SA-β-Gal活性适度降低，但不影响SI或溶酶体含量。剂量梯度实验显示，仅200和400 μM CIP可增加SA-β-Gal活性。CIP在EA.hy926内皮细胞和H9c2心肌母细胞中同样增加SA-β-Gal活性。在基因表达层面，CIP使CDKN1A/p21表达升高约3倍，使ANKRD1升高约2.5–3倍，使TRIM21升高约1.7倍；GDF15在三种氟喹诺酮处理后均升高至对照的2–3倍。然而，氟喹诺酮处理未上调所分析的前炎症细胞因子基因，IL6在MOX和LEV处理后显著降低，CXCL2在CIP和LEV处理后降低。分泌水平方面，7天时IL-1β、IL-6和IL-8分泌基本不变；14天时CIP使IL-1β分泌适度增加约1.3倍，提示至少一种SASP组分的延迟诱导。
3.2 环丙沙星在体外诱导人成纤维细胞DNA损伤反应和氧化应激
CIP显著增加了γH2AX阳性细胞比例和每个细胞核的平均γH2AX灶数，而MOX和LEV无显著效应。氧化应激时间进程实验显示，DHE信号在CIP暴露72小时后增加，DCF信号在孵育6小时后即增加，而MitoCLox荧光比值（520/590 nm）保持不变。
3.3 抗氧化剂减轻CIP诱导的DNA损伤反应、氧化应激和衰老样表型
CIP处理7天使γH2AX阳性核比例从对照的约2%升至约20–22%，而80 nM SkQ3或100 μM Trolox共处理可将其降至约10–12%。CIP使DHE荧光升高约1.5倍，Trolox和SkQ3均可使其降低约2倍。Trolox可将CIP诱导的DCF荧光升高降至对照水平，而SkQ3反而进一步增加DCF荧光。CIP未显著改变MitoCLox信号，但两种抗氧化剂均降低了基础MitoCLox信号。在衰老标志物方面，SkQ3和Trolox共处理均降低了CIP诱导的SA-β-Gal染色和SI升高，并使溶酶体荧光呈下降趋势。Western blot结果显示，CIP未增加p53、p16或p21蛋白水平，但降低了RB Ser795磷酸化；DOX阳性对照则增加所有上述蛋白。
3.4 环丙沙星撤除后细胞密度恢复
连续3周CIP暴露使刃天青荧光降至对照的约50%，而暴露1周后撤药2周、或暴露2周后撤药1周的细胞，其刃天青信号与未处理对照相当。形态学观察显示，连续3周CIP暴露的细胞密度明显降低，而撤药后细胞逐渐重新增殖并达到接近汇合的单层状态。
四、讨论与结论
本研究证明，长期暴露于高浓度环丙沙星可在人成纤维细胞中诱导非经典衰老样表型，该表型与氧化应激相关，并可被常规抗氧化剂和线粒体靶向抗氧化剂所减轻。CIP诱导的衰老样状态未伴随广泛的促炎SASP，也未出现p53、p16或p21蛋白的显著升高，但伴有RB Ser795磷酸化降低，提示其与经典DNA损伤诱导的衰老有所不同。CIP对衰老样表型的诱导具有选择性，MOX和LEV在可比条件下未产生类似效应，这可能与三种药物在化学结构、细胞摄取、组织分布、线粒体效应及基因毒性或氧化应激诱导能力方面的差异有关。撤药实验表明，CIP诱导的生长抑制在药物去除后可部分恢复，提示该衰老样状态具有可逆性，可能表型上与应激诱导的静止期（quiescence）存在重叠。
研究存在以下局限性：所用氟喹诺酮浓度高于临床常规静脉给药后的血浆峰浓度（Cmax）；药物以含辅料的静脉输注液形式给药，缺乏单独辅料对照；成纤维细胞仅来自3名健康男性供体，无法充分评估个体间差异和性别差异；高糖DMEM培养条件可能对结果产生一定影响；未直接评估凋亡标志物。尽管如此，CIP效应的供体间一致性、在两种额外细胞系中的可重复性，以及抗氧化剂对表型的减轻作用，均支持CIP诱导的氧化应激相关衰老样重塑这一结论。
研究结论：长期环丙沙星暴露在体外诱导人成纤维细胞中与氧化应激相关的非经典衰老样表型，伴随可逆的生长抑制。Trolox和SkQ3对γH2AX积累及多种衰老相关指标的减轻作用支持氧化还原失衡在该细胞反应中的贡献。
