POMC神经元中α7烟碱型乙酰胆碱受体缺失损害雄性小鼠能量平衡与瘦素诱导的厌食反应

《International Journal of Molecular Sciences》：Deletion of α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor in POMC Neurons Impairs Energy Balance and Leptin-Induced Anorexigenic Response in Male Mice

　　

近期研究表明，下丘脑神经元（包括前阿黑皮素原（POMC）神经元）中的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）调节能量稳态。本研究旨在探讨下丘脑POMC神经元中α7nAChR亚基如何影响小鼠的食物摄入和能量平衡。研究人员利用Cre-LoxP系统生成了POMC神经元特异性敲除α7nAChR的小鼠（对照组：α7nAChRfl/fl；敲除组：α7nAChRfl/flPOMCCre）。测量了体重（BW）和体重增长（BWG）。研究人员通过呼吸计量法评估能量消耗，并通过腹腔内葡萄糖耐量试验（ipGTT）和胰岛素耐量试验（ipITT）评估血糖稳态。在腹腔注射生理盐水（0.9%）、瘦素（5 μg/g BW）或选择性α7nAChR激动剂PNU-282987（1 mg/kg BW）后测量食物摄入量。随后，禁食小鼠被腹腔注射生理盐水（0.9%）、瘦素（2.5 μg/g BW）或PNU-282987（1 mg/kg BW），然后处死。进行了RT-qPCR和Western blotting分析。α7nAChRfl/flPOMCCre雄性小鼠初始体重较轻，但BWG更高。雌性小鼠则观察到相反情况。α7nAChRfl/flPOMCCre雄性小鼠表现出附睾脂肪增加、血清瘦素水平升高和食物摄入量增加。敲除雄性小鼠在葡萄糖稳态和信号传导方面未显示出明显损伤。此外，瘦素诱导的厌食反应延迟，伴随下丘脑厌食蛋白减少，以及在急性瘦素刺激后pCREBSer133呈降低趋势。PNU-282987处理在体外增加了pCREBSer133含量和Pcsk1基因表达。POMC神经元中表达的α7nAChR似乎有助于能量和血糖稳态，以及由CREB磷酸化介导的下丘脑瘦素诱导的厌食反应。

研究背景与科学问题

下丘脑是中枢神经系统调控能量稳态的关键区域，负责整合食物摄入与能量消耗之间的平衡。其中，弓状核作为能量代谢的核心中枢，接收来自外周的营养物质和激素信号，并通过多种神经元群如神经肽Y、刺鼠相关肽和前阿黑皮素原（POMC）神经元来调节饥饿与饱腹感。能量状态反映于循环中的瘦素、胰岛素等激素水平，这些激素可激活POMC神经元中的信号通路，促进负性能量平衡。例如，瘦素可通过JAK2-STAT3经典通路刺激POMC表达，同时钙离子内流触发cAMP反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化，增强编码转化酶的基因表达，进而加工POMC生成α-MSH，发挥抑制食欲的作用。

α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）是一种同源五聚体受体，兼具配体门控离子通道功能，对钙离子具有高通透性。已有研究表明，α7nAChR在下丘脑神经元中表达，其激动剂可降低体重和摄食量，而全身性敲除α7nAChR则损害糖代谢并增加脂肪堆积。然而，α7nAChR在不同下丘脑神经元亚群中的具体作用尚不明确。特别是在肥胖或高脂饮食条件下，α7nAChR表达可能下调，导致稳态紊乱。因此，研究人员提出假设：POMC神经元中的α7nAChR可能对能量调节和血糖控制至关重要。为验证这一假说，他们通过Cre-LoxP系统构建了POMC神经元特异性敲除Chrna7基因的条件性敲除小鼠，并在普通饲料喂养条件下评估其摄食行为、能量消耗、糖代谢及瘦素信号通路的变化。

研究方法概述

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）利用Cre-LoxP系统构建POMC神经元特异性α7nAChR敲除小鼠（α7nAChR^fl/flPOMC^Cre），以同窝α7nAChR^fl/fl小鼠为对照；（2）通过免疫荧光染色（α-MSH抗体标记POMC神经元，α-银环蛇毒素标记α7nAChR）确认基因敲除效率；（3）采用间接测热法（Oxymax-CLAMS系统）测定耗氧量、二氧化碳产量、呼吸交换率、产热、自发活动及摄食量；（4）进行腹腔内葡萄糖耐量试验（ipGTT）和胰岛素耐量试验（ipITT）评估血糖稳态；（5）通过急性腹腔注射瘦素或选择性α7nAChR激动剂PNU-282987，测定相对摄食量并收集下丘脑组织进行蛋白质印迹和RT-qPCR检测；（6）使用小鼠下丘脑POMC神经元细胞系（mHypoA POMC/GFP）进行体外药物刺激实验，检测pCREB^Ser133及Pcsk1基因表达。

研究结果

2.1 删除POMC神经元中的α7nAChR导致外周组织和下丘脑神经肽表达的能量平衡调控分子改变，并增加雄性小鼠暗周期摄食量

免疫荧光证实，对照组POMC神经元（α-MSH⁺）共表达α7nAChR（α-银环蛇毒素⁺），而敲除组无共定位。雄性敲除小鼠在第4至5周龄时体重较轻，但总体体重增长更高，且在第4周时腹膜后脂肪垫更重，血清瘦素水平升高。雌性敲除小鼠则表现为早期体重较重但总体增长较低。间接测热法显示，雄性敲除小鼠在4周和8周龄时暗周期摄食量显著增加，而耗氧量、二氧化碳产量、呼吸交换率、自发活动和产热无显著差异。外周组织分析表明，4周龄敲除小鼠附睾白色脂肪组织中pHSL^Ser565（激素敏感性脂肪酶抑制位点）蛋白水平升高，棕色脂肪组织中肉碱棕榈酰转移酶2蛋白水平升高，解偶联蛋白1呈上升趋势；8周龄时附睾白色脂肪组织中pAMPK^Thr172降低，棕色脂肪组织中PPARγ蛋白水平下降。下丘脑神经肽基因表达分析显示，4周龄敲除小鼠Cartpt表达显著降低，Pomc呈下降趋势，而Npy、Agrp和Prkaa2无变化。

2.2 POMC下丘脑神经元表达的α7nAChR对雄性小鼠肝脏葡萄糖稳态似乎不重要

腹腔内葡萄糖耐量试验结果显示两组间无显著差异。4周龄敲除小鼠在腹腔内胰岛素耐量试验中表现出更快的降糖效应（5分钟时），并伴有肝脏pFoxO1/3^Thr24/32蛋白含量升高。8周龄时，敲除小鼠葡萄糖耐量曲线下面积降低，肝脏pIRS^Ser307蛋白水平下降。综合来看，α7nAChR在POMC神经元中的缺失并未引起明显的糖稳态损害。

2.3 删除POMC神经元中的α7nAChR与瘦素厌食反应延迟相关，可能由pCREB^Ser133水平降低驱动，而非pSTAT3^Tyr705或acSTAT3^Lys685变化

在急性摄食实验中，对照组小鼠接受瘦素或PNU-282987注射后1至4小时摄食量均显著降低；而敲除小鼠仅在瘦素刺激后3小时才出现摄食减少，PNU-282987完全无效，表明厌食反应延迟。分子机制分析显示，瘦素注射后两组pSTAT3^Tyr705均升高，但敲除小鼠下丘脑acSTAT3^Lys685和POMC蛋白水平整体低于对照组，且pCREB^Ser133在瘦素刺激后呈下降趋势。PNU-282987处理仅增加对照组acSTAT3^Lys685，而敲除小鼠pCREB^Ser133水平降低。

2.4 体外激活α7nAChR诱导CREB磷酸化和上调Pcsk1基因表达，提示α7nAChR在POMC神经元中作为钙选择性离子通道发挥作用

在mHypoA POMC/GFP细胞中，瘦素和PNU-282987均显著提高pCREB^Ser133水平，而选择性α7nAChR拮抗剂甲基牛扁亭柠檬酸盐可阻断PNU-282987的效果。此外，PNU-282987处理上调了Pcsk1（一种受pCREB调控的前激素转化酶基因）mRNA表达，该效应同样被MLA逆转。

讨论与结论

本研究的核心发现是，下丘脑POMC神经元中α7nAChR的缺失损害了年轻雄性小鼠的摄食行为和瘦素厌食反应，但对葡萄糖稳态无明显影响。敲除小鼠表现出体重增长加快、附睾脂肪增多、血清瘦素升高以及早期pHSL^Ser565增加，同时暗周期摄食倾向增加和下丘脑厌食神经肽基因表达降低。更重要的是，α7nAChR缺失导致瘦素诱导的厌食反应延迟，PNU-282987的抑食效应完全消失。这种延迟可能源于α7nAChR作为钙选择性离子通道的功能丧失，从而降低了pCREB^Ser133水平及其下游靶基因的表达。

研究人员指出，乙酰胆碱在下丘脑呈昼夜节律性释放，进食期间达到高峰，这可能通过JAK2-STAT3通路促进厌食基因转录、抑制促食基因表达来维持饱腹感。α7nAChR缺失可能破坏了这一平衡。钙离子内流对于瘦素诱导的厌食反应至关重要，α7nAChR作为钙通道参与此过程：体外实验证实，激活α7nAChR可增加pCREB^Ser133和Pcsk1表达，而拮抗剂可阻断这些效应。CREB和CRTC1是调控Cartpt和前激素转化酶启动子的关键转录因子，后者负责将POMC加工为α-MSH等生物活性分子，最终通过结合黑皮质素受体4发挥抑制食欲的作用。

研究结论：综上所述，下丘脑POMC神经元中α7nAChR的表达影响能量平衡。其缺失导致雄性小鼠早期体重增加和脂肪增多，以及下丘脑厌食神经肽水平下降。此外，中枢α7nAChR似乎有助于调节肝脏葡萄糖水平和胰岛素敏感性。同时，α7nAChR对于瘦素驱动的食欲抑制至关重要，这可能与pCREB^Ser133（中枢厌食通路中关键酶的重要转录因子）水平的降低趋势有关。这些结果表明α7nAChR作为一种钙通透性离子通道发挥作用。