《International Journal of Molecular Sciences》：Cell Sheet Technology as a Platform for Functional Regeneration
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细胞片层技术（Cell Sheet Technology）已发展成为一种独特的无支架（scaffold-free）且无生物材料（biomaterial-free）的再生医学平台，能够在保留细胞外基质（extracellular matrix, ECM）及细胞间
细胞片层技术（Cell Sheet Technology）已发展成为一种独特的无支架（scaffold-free）且无生物材料（biomaterial-free）的再生医学平台，能够在保留细胞外基质（extracellular matrix, ECM）及细胞间相互作用的同时，实现完整细胞构建体的移植。细胞片层技术的临床应用已在角膜、食管、心脏、软骨及视网膜等组织的再生中显示出成功效果。近年来，细胞片层技术的治疗范围已从单纯的组织替代扩展至基于干细胞的再生治疗，其中旁分泌信号（paracrine signaling）、抗纤维化活性及微环境重塑发挥着重要作用。在本综述中，研究人员采用“功能性再生”（functional regeneration）这一术语，将其作为一个整合性治疗框架，用以描述再生医学平台通过促进再生过程来改变疾病病理生理学并可能改变疾病自然史的能力，无论是否实现完全的解剖重建。肝硬化（liver cirrhosis）是该功能性再生概念的典型目标疾病，因为能够逆转进行性纤维化并恢复肝功能的功能性再生治疗，有望预防肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的发生。本综述讨论了细胞片层技术的演变、基于干细胞的功能性再生的生物学基础，以及KCS-003的开发——这是一种由经IC-2预处理的间充质干细胞/基质细胞（mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）制备的细胞片层治疗产品，具有强效抗纤维化作用并可促进肝再生。此外，临床研究（包括角膜及视网膜重建、食管再生、软骨修复及心脏补片等）作为细胞片层技术的代表性临床应用案例予以展示。
主体内容总结
1. 引言
再生医学日益依赖创新生物材料和基于干细胞的策略来实现组织修复与再生。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）具有无限自我更新能力并可分化产生外胚层、中胚层和内胚层来源的多种特化细胞类型；间充质干细胞/基质细胞（mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）则具有多向分化潜能，在再生医学和临床实践中具有广泛适用性。干细胞通常需要适当的支架系统来最大化其生物学功能，包括水凝胶和纳米颗粒等先进生物材料可为干细胞增殖和分化提供支持性微环境。然而，生物材料面临免疫相容性、降解产物毒性、与宿主组织机械不兼容以及长期安全性等共同挑战。此外，基于单细胞注射的干细胞治疗常面临移植后大量细胞丢失、组织滞留率低和疗效短暂等问题。细胞片层技术作为一种无支架、不依赖生物材料的细胞递送平台，可减少异物反应、增强细胞活力、保持强效旁分泌活性并高效靶向受损组织。
2. 细胞片层技术作为无支架和无生物材料平台
细胞片层工程基于温度响应性培养表面，该表面涂覆聚（N-异丙基丙烯酰胺）（poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm），该聚合物在37°C时呈疏水性以促进细胞附着和增殖，在低于32°C时转变为亲水性从而使完整细胞单层温和释放。与传统收获方法不同，该方法无需蛋白水解酶，从而保留天然ECM、细胞间连接和膜相关蛋白。从临床验证的体细胞片层向间充质干细胞片层的转变代表了技术的概念性扩展。MSC经胰蛋白酶处理脱离培养表面时会丢失整合素β-1（integrin β-1），且磷酸化Yap表达增加，提示胰蛋白酶处理可诱导凋亡，而细胞片层技术则不会造成此类损伤。
3. 功能性再生的框架
再生医学最初设想通过治疗性细胞的移植和整合来恢复组织功能，但临床研究揭示了长期细胞存活和稳定组织整合方面的重大挑战。近年研究表明，干细胞治疗的治疗效果主要归因于其旁分泌活性而非植入和直接重建受损组织的能力。本综述将“功能性再生”定义为一个整合性治疗框架：通过改变病理组织微环境和激活内源性修复过程来恢复或持续改善具有临床意义的器官功能，而不要求完全的解剖重建或移植细胞的永久性结构植入。与传统再生医学、组织修复、旁分泌再生和疾病修饰性细胞治疗等概念相比，功能性再生的关键区别在于不要求完全的组织替代，同时强调再生性局部微环境的建立和器官功能的恢复。
4. 肝硬化作为功能性再生的代表性目标疾病
4.1 未满足的医疗需求
肝硬化是慢性肝病患者发病和死亡的重要原因，2019年占全球死亡人数的2.4%。失代偿期肝硬化患病率正在增加，从代偿期向失代偿期转变的年发生率为5–12%。代偿期肝硬化中位生存期超过12年，而失代偿期肝硬化预期中位生存期仅为2至4年。肝移植（liver transplantation, LT）是失代偿期肝硬化的唯一根治性治疗手段，但供体器官严重短缺，尤其在日本，因此失代偿期肝硬化存在显著未满足的医疗需求。
4.2 肝纤维化/肝硬化中肝再生的生物学障碍
肝硬化中肝再生受到多种生物学障碍的严重损害。第一，广泛的ECM积累和瘢痕形成破坏正常再生微环境，导致结构扭曲、血管重塑、功能性实质细胞丧失和持续性炎症。第二，慢性炎症和免疫失调显著阻碍再生过程，巨噬细胞的持续激活促进纤维形成和疾病进展。第三，肝细胞衰老是再生的另一重要障碍，衰老肝细胞分泌的生物活性介质可刺激肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化和纤维形成。第四，导管反应（ductular reaction, DR）在慢性肝病中可能变为适应不良，持续性失调的DR与慢性炎症、纤维形成和肝功能恶化相关。第五，晚期肝硬化伴随广泛血管重塑，包括肝窦毛细血管化、内皮功能障碍和门静脉高压。第六，再生信号通路在慢性肝损伤期间失调，TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Hippo/YAP和Hedgehog等关键分子通路的持续激活促进病理性纤维化。
4.3 KCS-003
4.3.1 KCS-003作为使用IC-2介导的MSCs的细胞片层治疗
KCS-003是一种基于细胞片层的再生治疗，利用自体骨髓来源的MSCs，在移植前经IC-2处理。IC-2是Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂，由作者作为ICG-001的衍生物开发。KCS-003通过在温度响应性培养皿上于IC-2存在下培养骨髓来源MSCs 9天制备，然后应用于失代偿期肝硬化患者的肝脏表面。该产品具有以下关键特征：解决失代偿期肝硬化患者显著未满足的医疗需求；显示强效治疗潜力；具有提供持续生物学效应的潜力；有完善且经科学验证的作用机制支持；通过治疗潜在肝硬化可能降低肝细胞癌发生风险；可在未来临床研究中作为支持性或桥接策略评估。
4.3.2 KCS-003的功效、分子机制和安全性考虑
在急性肝损伤模型中，KCS-003移植后2天ALT、AST和总胆红素水平显著降低，Ki-67阳性肝细胞显著增加，PCNA表达逐渐升高。补体C3在移植KCS-003的肝脏中强表达，C5a上调，通过激活NF-κB和STAT3通路促进肝再生。EGFR受体配体（如HB-EGF和双调蛋白）在移植KCS-003的肝脏中增加。硫氧还蛋白（thioredoxin, TRX）系统显著促进氧化应激的降低。
在慢性肝损伤模型中，KCS-003显著降低血清ALT，组织学分析显示肝脏纤维化显著减少，羟脯氨酸含量降低，I型和III型胶原均减少。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达显著降低，提示HSC活化受抑。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）中，分泌型MMP-14在KCS-003的抗纤维化作用中发挥主要作用，siRNA敲低实验证实了这一点。
安全性方面，KCS-003具有MSC表型稳定性、低致瘤风险、低免疫原性、有限的长期存留以及标准化制造和质量控制等特征支持其安全性。
5. 细胞片层技术在其他器官系统的临床应用
Nishida等报道了自体口腔黏膜上皮细胞片层移植治疗双侧完全性角膜干细胞缺乏症，4例患者均在1周内实现角膜表面完全再上皮化，角膜透明度恢复，术后视力显著改善。Ohki等报道了内镜下自体口腔黏膜上皮片层移植预防内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection, ESD）后食管狭窄，25例患者中17例成功预防狭窄。Sato等报道了软骨细胞片层移植联合常规手术治疗膝骨关节炎，8例患者经MRI、关节镜、组织学和临床评分评估显示有效。Mandai等报道了自体诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞片层移植治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD），移植后1年细胞片层保持完整，无严重并发症。Kawamura等报道了iPSC来源心肌细胞补片移植治疗3例缺血性心肌病患者，心衰症状改善，左心室收缩力和心肌血流在2例患者中改善。
6. 未来展望
除细胞片层技术外，类器官移植、生物人工器官、三维（3D）生物打印以及小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）特别是外泌体等新兴再生方法也具有广阔前景。细胞片层技术面临的关键挑战包括建立可靠的同种异体移植策略、优化冷冻保存方法以及开发高效的递送装置和移植系统。这些方法应被视为互补而非相互排斥的关系。
