《Molecules》：Bioactive Ingredients in the Mediterranean Diet for Hepatic Health: In Vitro Evaluation of Selected Extracts Against Non-Alcoholic Steatosis
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源自地中海饮食的天然产物因其抗氧化和抗炎特性，以及对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等代谢紊乱的有益作用，已成为颇具潜力的药物先导化合物而受到广泛关注。本研究在体外HepG2肝脂肪变性模型中，研究了香芹酚、百里香酚、罗勒精油和番茄红素的单独及联合
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源自地中海饮食的天然产物因其抗氧化和抗炎特性，以及对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等代谢紊乱的有益作用，已成为颇具潜力的药物先导化合物而受到广泛关注。本研究在体外HepG2肝脂肪变性模型中，研究了香芹酚、百里香酚、罗勒精油和番茄红素的单独及联合作用。首先通过2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）和2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除实验确认了其抗氧化活性。油红O染色、LipidSpot?免疫荧光和TBARS实验表明，各处理组显著降低了细胞内脂质积累和脂质过氧化。此外，这些天然化合物通过上调β-氧化和脂肪分解相关标志物PPARα、CPT1α和ATGL，同时下调脂肪生成调控因子PPARγ和促炎酶5-脂氧合酶，恢复了脂质稳态。联合配方持续表现出最强的生物活性，在减少脂质积累、氧化应激和氧化性DNA损伤方面显示出增强的功效，表现为8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxo-dG）形成减少。总体而言，这些结果表明，地中海饮食来源的生物活性物质，尤其是联合使用时，通过减少氧化损伤、恢复脂质稳态和调节炎症通路发挥多靶点抗氧化活性，支持其在基于天然产物的NAFLD预防和管理策略中的潜在应用。
论文解读
一、研究背景与研究目的
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病之一，其病理特征为肝脏脂质过度积累、肝脂肪变性以及氧化还原稳态失衡。不健康的生活方式和不良饮食习惯从早年即开始影响人类健康，推动了代谢紊乱疾病负担的持续上升。目前，基于生活方式的干预策略，包括热量控制饮食和规律体育锻炼，被视为一线治疗方案，尤其是针对儿童肝脂肪变性患者。然而，针对药物治疗的研究结果往往不一致且常相互矛盾。
在此背景下，功能性食品及其天然活性成分被认定为日常生活中预防和治疗肝脏疾病的关键因素。地中海饮食作为一种以植物为基础的饮食模式，富含维生素、类胡萝卜素、不饱和脂肪酸和具有抗氧化及抗炎特性的植物酚类化合物，是天然活性分子的重要来源。其中，多酚和萜类化合物发挥着主导作用；罗勒、百里香和牛至等地中海国家饮食中广泛使用的芳香草本植物，富含丁香油酚、百里香酚和香芹酚等生物活性分子。番茄作为地中海饮食的关键组成部分，是番茄红素等类胡萝卜素的重要来源，已被证实具有抗氧化、保肝等多重健康益处。
尽管前期临床前和临床研究已分别证实罗勒、香芹酚、百里香酚、丁香油酚和番茄红素各自的抗氧化、氧化还原调节和保肝作用，但它们的联合生物活性从未在单一实验体系中得到系统研究。此外，近期证据表明，香芹酚、百里香酚和番茄红素在间充质基质细胞中可作为强效的衰老治疗剂，通过受控的促氧化机制选择性清除衰老细胞，凸显了这些萜类化合物在不同剂量和细胞环境中兼具保护性或细胞毒性作用的双重生物活性。
因此，本研究旨在利用基于HepG2细胞的体外NAFLD模型，系统研究香芹酚、百里香酚、罗勒精油和番茄红素单独及联合使用时所调节的关键生化标志物。理解各组分各自的贡献及其联合效应，可为开发靶向恢复氧化还原稳态、调节氧化应激、脂质失调和NAFLD进展相关炎症通路的功能性食品或膳食补充剂提供指导。同时，评估这些化合物在较低剂量下联合使用是否能够维持或增强单一化合物在较高剂量下的生物活性，有助于开发更安全、更有效的NAFLD预防和管理膳食策略。
二、主要技术方法
研究人员采用了多项关键技术手段开展研究。首先利用超高效液相色谱（UPLC）对香芹酚、百里香酚、番茄红素和罗勒精油进行分析表征，确认其纯度及化学成分组成。抗氧化活性通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估。细胞实验方面，以人肝癌细胞系HepG2（购自ATCC）为模型，采用亚油酸和油酸（1:1 v/v）混合物诱导脂肪变性，模拟体外NAFLD状态。生物相容性通过MTT实验评估。脂质积累分别通过油红O染色和LipidSpot?免疫荧光检测。基因表达采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析，蛋白表达采用Western blot检测。脂质过氧化通过硫代巴比妥酸反应物（TBARS）实验评估，氧化性DNA损伤通过8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxo-dG）免疫荧光检测。
三、研究结果
3.1 分析表征与抗氧化评价
UPLC分析确认了番茄红素、香芹酚和百里香酚的高纯度，各显示单一峰。罗勒精油主要以丁香油酚（23%）为特征成分，含微量（<1%）香芹酚和百里香酚。DPPH和ABTS实验显示，所有化合物均呈现剂量依赖性抗氧化活性。罗勒精油活性最高，在0.8 μM浓度下达85±3%抑制率，而百里香酚、香芹酚和番茄红素在同一浓度下分别为66±7%、68±2%和57±3%。所有精油在最高测试浓度下均达到约90%的抑制率。
3.2 MTT生物相容性评价
在0.1–2.5 μM浓度范围内，精油和番茄红素单独或联合处理HepG2细胞24 h和48 h，在所有实验条件下均表现出完全生物相容性，未影响细胞活力。
3.3 油红O染色检测总脂质积累
游离脂肪酸（FFA）处理的细胞脂滴显著增加，确认了脂肪变性表型的建立。天然化合物处理后，脂质积累明显减少。分光光度定量分析显示，所有处理组的510 nm吸光度均较FFA处理组显著降低，其中联合配方的脂质含量降低最为显著（p≤0.0001）。
3.4 免疫荧光评价脂质积累
免疫荧光分析证实了油红O染色的结果。FFA处理细胞显示更高的绿色荧光信号，表明脂质积累增加。天然抗氧化生物活性物质单独或联合处理均降低了细胞内脂质含量，其中百里香酚、罗勒精油和联合配方的效果更为显著。联合配方效果最强，荧光强度较FFA组降低1.6倍。
3.5 qRT-PCR基因表达评价
FFA处理有效诱导了脂肪变性表型，显著上调PPARγ和5-LOX表达，同时下调PPARα、CPT1α和ATGL表达。所有处理均显著下调PPARγ表达，其中番茄红素、罗勒精油和联合配方的下调倍数分别为4.42、3.57和3.48倍，而香芹酚无显著效果。所有化合物均增强β-氧化，表现为PPARα和CPT1α的上调：罗勒精油对PPARα的诱导最强（7.6倍），联合配方对CPT1α的上调最有效（13.5倍）。脂肪分解活性亦得到改善，所有处理组的ATGL表达均增加，范围从联合配方的5.5倍到香芹酚的7.6倍。5-LOX表达被香芹酚、百里香酚和联合配方显著下调，联合配方抑制作用最强，降低约2.27倍。
3.6 Western blot蛋白表达评价
Western blot结果与qRT-PCR结果一致。FFA处理显著上调5-LOX蛋白表达，而所有精油和番茄红素处理均显著降低其表达，其中番茄红素和联合配方分别降低约1.7倍和1.9倍。PPARα表达在FFA处理下受抑制，经天然化合物处理后显著恢复，联合配方效果最强（较FFA组增加4倍）。PPARγ在FFA处理下上调，经精油和番茄红素处理后下调，联合配方效果最显著，较FFA处理组降低3.2倍。
3.7 TBARS脂质过氧化实验
在预防模式下，H?O?和FFA+H?O?处理组较未处理对照组脂质过氧化显著增加。番茄红素显著降低脂质过氧化，联合配方也显著降低脂质过氧化，表明其具有增强的保护效应。在修复模式下，所有处理均显著降低脂质过氧化，其中联合配方效果最强，降低约18倍，是抵抗氧化损伤最有效的条件。总体而言，联合配方在修复模式下对氧化应激诱导的脂质过氧化表现出更显著的效果。
3.8 8-氧代鸟嘌呤检测（氧化性DNA损伤）
免疫细胞化学分析显示，罗勒精油、番茄红素和联合配方处理后，8-oxo-dG阳性细胞百分比显著降低，分别减少约1.2倍、1.6倍和5倍。香芹酚和百里香酚的效果较弱。
四、讨论总结与研究结论
本研究表明，地中海饮食来源的植物化学物质，尤其是联合使用时，通过多种相互关联的机制发挥保护作用，其中氧化还原调节是其生物学作用的核心组成部分。这些化合物在低微摩尔浓度下主要发挥抗氧化和细胞保护作用，减少脂质诱导的氧化应激，与高浓度下在衰老环境中作为促氧化细胞清除剂的效应形成鲜明对比，体现了剂量和环境的依赖性。从营养学角度看，体外使用的浓度不应直接等同于膳食暴露水平，因为吸收、代谢、生物利用度和组织分布会显著影响体内实际达到的浓度。研究结果支持这些化合物作为功能性成分用于管理NAFLD相关改变的潜在价值，联合配方的增强活性表明多组分策略可能比单一化合物提供更多获益。然而，番茄红素等关键分子的膳食摄入量往往不达标，这支持开发功能性食品或营养保健品策略以达到生物学相关剂量。
研究结论指出，地中海饮食来源的植物化学物质是有前景的天然化合物，能够减轻氧化损伤、调节脂质稳态并影响NAFLD相关细胞改变中的炎症通路。在实验条件下，联合处理在多个参数上比单独处理表现出更显著的效果，尽管需要进一步研究阐明化合物间相互作用的本质。这些发现为地中海饮食来源植物化学物质在体外NAFLD模型中的潜在生物活性提供了机制证据，并强调氧化还原调节是其细胞效应的重要组成部分。未来需要进一步的体内和临床研究来确定这些观察结果能否在更复杂的生物系统中重现，并确立其在膳食或营养保健品应用中的潜在相关性。
