颈部淋巴清扫损害脑淋巴清除和突触蛋白稳态并诱导海马氧化性蛋白微聚集

《Neuron》：Cervical lymphadenectomy impairs brain lymphatic clearance and synaptic proteostasis

　　

脑膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels）将脑液和废物引流至颈淋巴结（cervical lymph nodes），但手术中切除这些淋巴结如何影响脑健康尚不清楚。对接受颈部淋巴清扫术（neck lymphadenectomy）且未接受放化疗（chemo-radiation therapy）的癌症患者进行回顾性分析发现，高达25%的患者出现轻至重度认知障碍（cognitive impairment），神经影像（neuroimaging）显示双侧手术后颞角（temporal horn）扩大加速。为从机制上确定颈部淋巴清扫术如何导致认知障碍，研究人员利用小鼠和大鼠模型模拟引流至颈和下颌下淋巴结（cervical and submandibular nodes）的淋巴流突然中断。淋巴引流（lymphatic drainage）受损诱导脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）代谢应激（metabolic stress）和炎症（inflammation）特征。在海马（hippocampus）中，氧化还原应激（redox stress）驱动氧化翻译后蛋白修饰（oxidative posttranslational protein modifications）和微聚集（microaggregation），其生化、分子和结构特征不同于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）模型中的淀粉样蛋白聚集（amyloid aggregates）。当淋巴引流逐渐减少时，这些变化不存在。这些数据将急性颈部淋巴清扫术后的认知障碍与代谢废物清除受损的生化后果联系起来。

研究背景：头颈癌（head and neck cancers, HNCs）是异质性恶性肿瘤，其中头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）最常见，约占全球死亡3%，为全球第七常见癌症。HNSCC常首先转移至颈部淋巴结盆，手术淋巴清扫和/或放化疗是常见治疗。每侧颈部有近100个淋巴结，分为浅、深及前、外侧颈部淋巴结，并划分为七个解剖区；颈、颏下和下颌下淋巴结接收脑膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels）流出。脑间质液和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）可通过硬脑膜上矢状窦蛛网膜颗粒、脑膜淋巴管、颅神经和筛板等路径引流至颈部淋巴结。淋巴系统参与神经退行性疾病、衰老和卒中后液体及蛋白聚集体清除。然而，急性淋巴流中断对正常脑组织的后果尚未被充分研究；尽管结扎淋巴管的野生型小鼠在行为记忆测试中受损，提示急性脑淋巴流中断可能促进认知障碍。研究人员因此开展回顾性临床分析和啮齿动物模型研究，论文发表于《Neuron》。研究结论为：急性颈部淋巴清扫术后的认知障碍与代谢废物清除受损的生化后果相关。

关键技术方法：主要包括Einstein-Montefiore队列（2013—2023）1035例HNSCC患者的回顾性临床分析，以及Technical University of Munich队列619例患者分析，其中190例接受颈部淋巴清扫且无放化疗，59例有术前和术后MRI；动物采用C57BL/6J小鼠8—12周龄、雌雄兼用，以及约3月龄雌性Sprague Dawley大鼠；建立小鼠引流至深颈淋巴结的传入淋巴管结扎模型、大鼠传入淋巴管烧灼模型、sham和naive对照，并使用AAV9-mVEGFR3^1-4-Ig（AAV-sR3）与AAV-mVEGFR3^4-7-Ig对照诱导慢性脑膜淋巴损害；采用CSF采集、DCE-MRI、TMT10plex定量蛋白质组学、靶向代谢组学、DIA-PASEF海马蛋白质组学、场流分离（flow field fractionation, FFF）分离微聚集、LC-MS/MS、翻译后修饰（posttranslational modification, PTM）分析、OxyBlot、ELISA及生物信息学分析。

研究结果：
1. 接受急性颈部淋巴清扫术的受试者认知障碍发生率增加。通过回顾性分析发现，在颈部淋巴清扫且无放化疗并有至少2年随访的患者中，年龄<65岁者18%出现轻至重度认知障碍，年龄匹配人群为4%—6%；年龄≥65岁者25%，年龄匹配人群为10%—22%。第二队列中，双侧淋巴清扫患者术后颞角扩大速度显著快于单侧患者，双侧年扩大率为17%±2.7 SEM，单侧为4.2%±2.9 SEM，提示双侧颈部淋巴清扫加速脑室颞角扩大。
2. 脑淋巴引流至颈淋巴结受损的啮齿动物模型。研究人员建立小鼠淋巴管结扎、大鼠传入淋巴管烧灼模型，并设sham和naive对照，同时采用AAV-sR3诱导慢性脑膜淋巴损害；通过CSF示踪剂GadoSpin-P验证模型成功，显示急性脑淋巴引流中断模型可模拟临床淋巴清扫。
3. 急性脑淋巴引流受损上调de novo NAD⁺和NADPH⁺通路。通过对naive、sham和结扎小鼠CSF进行主成分分析和靶向代谢组学，发现结扎组de novo NAD⁺合成通路和戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）上调，且短链酰基肉碱增加，提示CSF出现氧化还原补偿和代谢应激。
4. 急性脑淋巴引流受损上调de novo GSH合成。通过CSF代谢组和TMT-MS3定量蛋白质组学，发现谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽（glutathione, GSH）、胱硫醚、牛磺酸和GSH二硫化物增加，GSH合成酶上调；细胞外ATP及其水解产物AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和黄嘌呤增加，损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）钙网蛋白和S100增加，提示氧化还原失衡和早期细胞损伤。
5. 急性脑淋巴引流受损诱导轻度炎症性CSF特征。通过对小鼠CSF 729个蛋白的TMT-MS3定量分析，结扎组153个蛋白显著改变，GSH和糖酵解通路上调，轴突发生、轴突导向和细胞黏附相关蛋白下调；免疫激活、急性期反应、白细胞介素、JAK-STAT信号和白细胞迁移上调，ELISA验证IL-1β、GM-CSF、CXCL2和CCL3增加；大鼠烧灼模型出现类似代谢、炎症、突触、蛋白水解和血管通路改变。
6. 急性脑淋巴引流受损改变海马蛋白稳态。通过DIA-PASEF海马蛋白质组学，sham和结扎小鼠间鉴定出72个差异蛋白，富集于线粒体功能障碍、细胞应激反应、突触发生受损、适应性免疫信号和神经炎症；AAV-sR3慢性脑膜淋巴损害模型海马蛋白质组无明显变化，且结扎组较AAV-sR3组上调多种细胞损伤、炎症和免疫细胞活化相关蛋白，提示急性而非逐渐淋巴损害改变海马蛋白稳态。
7. 急性淋巴引流受损促进脑蛋白羰基化和微聚集。通过FFF结合自下而上蛋白质组学质谱分离高分子量蛋白组装体，结扎小鼠fraction 7微聚集占注射蛋白质组的8%±2%，sham为<1%±0.2%；微聚集呈圆形无定形，分子量1×10⁸—1×10⁹，类似衰老组织而非AD淀粉样纤维和斑块；OxyBlot显示蛋白羰基化增加，但Congo red和AF11未检测到宏观聚集。
8. 海马蛋白微聚集源于蛋白羰基化。对fraction 7中880个蛋白进行LFQ分析，98%在sham和结扎组重叠，但78%在结扎组增加2.0—33倍；高丰度蛋白包括突触囊泡生物发生和运输相关蛋白，如synapsin I和II、微管相关蛋白和线粒体蛋白；TAU、α-synuclein和β淀粉样蛋白存在但谱计数低。ANuPP显示71.4%聚集蛋白质组ANuPP评分<200，而Zagg、TANGO和GAP评分较高；PTM分析显示泛素化、硫酸化、羰基化、羧化、瓜氨酸化、糖化及HNE/ONE修饰增加，提示其分子特征不同于AD。
9. 富含微聚集的线粒体蛋白质组特征。通过GO注释，fraction 7中超过70%蛋白映射至突触前线粒体区室；氧化磷酸化复合体I—V、超氧化物歧化酶、peroxiredoxin-5、GSH S-transferase及线粒体补体成分1Q亚成分结合蛋白等在结扎组富集；PTM分析显示ATP合酶和peroxiredoxin-5线粒体亚型等发生羧化、丁酰化及泛素化，提示突触区线粒体对氧化应激尤为敏感。
10. 富含微聚集的突触前蛋白质组特征。通过SynGO、GSEA和GO注释，非线粒体fraction 7蛋白质组富集突触前结构和囊泡相关蛋白；synapsin-1聚集倾向区域与氧化PTM位置邻近，synaptotagmin-1、synaptojanin-1和syntaxin-binding protein-1等突触囊泡循环蛋白存在氧化PTM和泛素化，提示突触前囊泡蛋白是微聚集主要成分。
11. 整合全局代谢组和蛋白质组分析将急性淋巴引流受损与神经退行性脑损伤联系起来。研究人员将CSF、海马和脑微聚集的代谢组与蛋白质组整合，计算变异系数、参考变化值和比值，映射Reactome/KEGG通路并归纳为能量/氧化还原/线粒体、蛋白稳态/应激、炎症/免疫、细胞外基质重塑、突触/囊泡信号/神经传递五类；CSF（100%）和海马（92.5%）显著性最高，提示急性淋巴引流受损与神经退行性脑损伤共享分子通路。

讨论部分总结：接受广泛单侧或双侧颈部淋巴结手术切除且无辅助治疗的患者中，按年龄分别有18%和25%在术后2年内出现认知障碍，总体为年龄和性别匹配人群的2—4倍；神经影像显示双侧较单侧淋巴清扫后颞角增大更快，提示双侧颈部淋巴清扫可能促进脑萎缩。CSF分析显示氧化应激，包括de novo NAD⁺生物合成、PPP和GSH合成通路激活；CNS氧化还原失衡伴随细胞外DAMPs如ATP、钙网蛋白和S100增加，并出现轻度炎症特征，如IL-1β和GM-CSF上调。FFF检测到高分子量蛋白微聚集，其圆形无定形形态不同于AD模型中的淀粉样纤维和斑块，而与衰老组织聚集相似；聚集蛋白质组包含TAU、α-synuclein和APP，但仅占少数，因此与AD聚集类似但不重叠。大多数微聚集蛋白来自突触囊泡生物发生和运输以及突触线粒体；突触前线粒体蛋白质组具有独特抗氧化和钙缓冲功能，突触蛋白如synapsin 1、syntaxin、synaptojanin-1、synaptotagmin-1、synaptophysin和amphiphysin富集。微聚集蛋白质组高度赖氨酸泛素化，并出现羰基化、氧化、硫酸化、乳糖化、瓜氨酸化、硝化、乙酰化及HNE/ONE修饰，提示受损蛋白降解和蛋白稳态失衡。急性模型揭示了急性与长期淋巴引流中断的重要差异；研究结论为：这些数据将急性颈部淋巴清扫术后的认知障碍与代谢废物清除受损的生化后果联系起来。讨论还指出，尽管这些发现需要在多中心临床环境中进行准确前瞻性验证，但目前审慎考虑保留颈部淋巴结引流的策略，以尽量减少神经认知后果。