《Applied and Environmental Microbiology》：Microfluidic-based high-throughput isolation enhances the recovery of novel strains and diversity from Arctic soil microbiome
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微生物培养对于理解环境微生物的生理学、生态学及生物技术潜力仍然至关重要，然而基于平板的传统方法（conventional plate-based methods，CPM）仅能回收环境微生物组中极小的一部分。极地地区，尤其是北极土壤，代表着独特的“
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微生物培养对于理解环境微生物的生理学、生态学及生物技术潜力仍然至关重要，然而基于平板的传统方法（conventional plate-based methods，CPM）仅能回收环境微生物组中极小的一部分。极地地区，尤其是北极土壤，代表着独特的“微生物暗物质”（microbial dark matter）储存库，由于寡营养条件、低温和冻融循环对微生物生长施加了严苛的生理限制，这些微生物难以培养。本研究首次系统性地将微流控液滴技术（microfluidic droplet technology，MDT）应用于北极活动层土壤微生物群，并在相同的起始细胞数量、R2A培养基和15°C孵育条件下，将其性能与传统方法（CPM）进行了基准比较。MDT的回收率较CPM提高了6.5至8.1倍，分离通量提升了180倍以上。基于近全长16S rRNA基因测序（PacBio）的结果显示，MDT在所有分类水平上均恢复了显著更高的分类丰富度，其中高细胞输入组（DropAS_H）检出256个属，而对应的平板组（PlateAS_H）仅检出211个属。值得注意的是，MDT产生了更均匀的群落分布，显著降低了快速生长的富营养型微生物（copiotrophs）如假单胞菌属（Pseudomonas）和黄杆菌属（Flavobacterium）的优势度。此外，MDT获得的序列中约50%归属于潜在新物种（与模式菌株的16S rRNA基因一致性<98.65%），27%归属于潜在新属（一致性<95%）。通过Sanger测序进行的菌株验证确认，17株分离菌中有12株为候选新物种，其中一株代表Devosiaceae科内的潜在新属。本研究证明，MDT是获取极地土壤微生物群中未培养微生物的有力平台，并建立了一条用于高通量分离新型耐冷细菌的完整流程。
论文解读
一、研究背景与科学问题
微生物培养是理解环境微生物生理功能、生态角色及生物技术潜力的基石，但学界公认，利用传统平板培养方法（conventional plate-based methods，CPM）可培养的环境微生物不足1%，这一现象被称为“大平板计数异常”（Great Plate Count Anomaly）。其余未培养微生物构成了亟待发掘的“微生物暗物质”（microbial dark matter）。尽管高通量测序已揭示约40万种原核生物的存在，但绝大多数已培养细菌仅集中于变形菌门（Pseudomonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、芽孢杆菌门（Bacillota）和放线菌门（Actinomycetota）四大门类，凸显了严重的培养偏倚。
极地地区，特别是北极活动层土壤，被认为是新型微生物物种的独特储存库。这些区域长期面临低温、冻融循环、寡营养、干燥及强紫外辐射等极端环境压力，塑造了以耐冷、生长缓慢、代谢速率低和滞后期延长为特征的微生物群落，使其在常规实验室条件下极难复苏和培养。此前的研究显示，传统平板法在北极永久冻土中仅能回收宏条形码检测到的细菌属的6.37%。尽管已有原位培养方法如cryo-iplate、扩散室（diffusion chambers）、iTip和iPore等被应用于北极样本，但培养效率提升有限。因此，亟需高通量、高效率的新型培养技术来突破北极土壤微生物培养瓶颈。
微流控液滴技术（microfluidic droplet technology，MDT）通过将单个细胞封装于皮升至微升级液滴中，构建物理隔离的微型生物反应器，可有效缓解种间竞争，防止快速生长菌株压制慢生长或休眠细胞。该技术已在非极地土壤和肠道微生物组中展现出优于传统方法的培养效果，包括更高的丰富度和独特属的回收。然而，MDT此前从未被应用于北极土壤微生物的分离与培养。本研究正是针对这一空白，首次系统评估MDT在北极活动层土壤微生物分离培养中的性能。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员于2023年9月中国北极科学考察期间，在斯瓦尔巴群岛斯匹次卑尔根岛新奥勒松附近的黄河站采集了活动层土壤样本。样本采集后于4°C保存并运回国内实验室。研究采用以下关键技术方法：
第一，细胞提取与预评估。将约1.5 g土壤样本悬浮于无菌生理盐水中，经涡旋振荡和温和超声处理使细胞与土壤颗粒分离，静置沉降后取上清液，利用血球计数板进行总细胞计数，并通过平板菌落计数（colony-forming unit，CFU）预评估可培养率约为0.04%。
第二，微流控液滴分离培养。采用MISS Cell单细胞微升级液滴筛选系统（TMAXTREE Biotech，中国无锡），基于泊松分布模型（Poisson distribution model）设定λ值为0.1，液滴体积约2.0–2.5 μL，目标封装浓度为48 CFU/mL，对应细胞密度约1.2×10? cells/mL。共生成两组液滴：低细胞输入组（DropAS_L，11,895个液滴，孵育30天）和高细胞输入组（DropAS_H，11,534个液滴，孵育17天），均在15°C下于密封特氟龙管中孵育。同时以相同起始细胞数设置对应平板对照组（PlateAS_L和PlateAS_H）。
第三，高通量测序与生物信息学分析。对液滴和培养平板收集的细胞进行DNA提取，利用27F/1492R引物扩增近全长16S rRNA基因，在PacBio Sequel平台测序。序列经CCS、QIIME 2流程（v2024.2.0）进行质控、去重和嵌合体去除，以SILVA v138.1数据库进行分类注释。此外，从LPSN数据库和NCBI下载模式菌株16S rRNA基因序列构建参考数据库，通过BLASTn比对评估潜在新物种（<98.65%一致性）和新属（<95%一致性）。
第四，菌株验证。随机选取50个微液滴在R2A平板上纯化，挑选形态不同的菌落进行Sanger测序，通过EzBioCloud服务器进行物种鉴定。
三、研究结果
MDT实现了比CPM更高的回收率。 在相同起始细胞数条件下，DropAS_L组（15°C，30天）获得约1,300个可见生长的微液滴，而PlateAS_L组仅约160个CFU，回收率提高8.1倍；DropAS_H组（15°C，17天）获得2,939个微液滴，PlateAS_H组约450个CFU，回收率提高6.5倍。此外，PlateAS_L组在30天孵育中出现了严重的真菌污染，而MDT的油包水乳液密封系统有效避免了这一问题。
MDT显著提升了分离通量和效率。 MISS Cell系统以每小时5,000–10,000个液滴的自动化通量运行，两次实验共收集4,239个含显著生长的微液滴。按获取4,200株纯培养物计算，传统平板法需8,400–12,600个平板、约190 L培养基和60–75个工作日，而MDT仅需约8小时仪器运行时间，效率提升超过180倍，且大幅减少了耗材、试剂和孵育空间。
MDT在所有分类水平上恢复了更高的分类丰富度和均匀度。 经PacBio测序和QIIME 2质控后，每组保留23,423–39,899个高质量扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）。四个实验组共鉴定出22个门和283个属。在所有分类水平上，DropAS_H均排名第一，含256个属（含未分类属），比PlateAS_H的211个属多45个；DropAS_L比PlateAS_L多59个属。在门水平上，DropAS_H和DropAS_L分别比对应平板组多检出3个和2个门。
MDT增强了稀有属的回收并降低了富营养菌丰度。 四个组间仅41个属（11%）共享，DropAS_H拥有最高的独有属数（61个，17%），PlateAS_L最低（5个，1%），相差12.2倍。假单胞菌属（Pseudomonas）和黄杆菌属（Flavobacterium）在所有组中占优势，但相对丰度差异显著：两者在PlateAS_H中合计占94.3%，在DropAS_L中仅占32.2%。MDT组表现出更高的属丰富度和均匀度，DropAS_L含有最高比例的稀有属（17.5% vs PlateAS_H的2.1%）。
MDT和CPM富集了不同的微生物类群。 多个分类水平的未分类细菌在MDT中的丰度比CPM高40倍以上，芽孢杆菌属（Bacillus）、Massilia属、Mucilaginibacter属、Brevundimonas属和Arenimonas属在MDT中富集达1,600倍以上。柄杆菌属（Caulobacter，1.1%–3.6%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Cryobacterium属、Pelomonas属、Nocardioides属、Paucibacter属等13个属仅在MDT中检出而在CPM中完全缺失。长孵育时间在两组方法中均倾向于富集特定类群，如假arthrobacter属和Polaromonas属。
MDT恢复了更多潜在新分类单元。 以98.65%和95%的16S rRNA基因一致性阈值判定，DropAS_H中49.5%的序列代表潜在新物种、27.2%代表潜在新属，为所有组中最高；PlateAS_H最低，分别为22.2%和9.8%。MDT组检出的潜在新物种和新属数量是CPM组的1.6–2.2倍。对与模式菌株一致性低于82%的序列构建系统发育树后发现，超过半数序列与模式菌株分开聚类，鉴定出10个推定新目级别的潜在簇，多数属于拟杆菌门（Bacteroidota），另有来自螺旋体门（Spirochaetota）、芽孢杆菌门、Kiritimatiellota门和疣微菌门（Verrucomicrobiota）的潜在新分类单元。
菌株分离验证。 随机选取50个微液滴进行验证，单个液滴在R2A平板上通常产生均匀菌落，表明液滴内多为单一物种。17株成功测序的菌株与最近模式菌株的16S rRNA基因一致性为92.92%–100%，其中12株低于98.65%，代表Arthrobacter、Bacillus、Flavobacterium、Mesorhizobium、Nocardioides、Polaromonas和Sphingomonas属内的潜在新物种。菌株S-114-7H与Devosia insulae DS-56的一致性仅为92.92%，提示Devosiaceae科内的潜在新属。
四、讨论与结论
讨论部分指出，MDT较CPM的核心优势在于通过物理隔离缓解种间竞争，释放了被快速生长富营养菌压制的慢生长和稀有类群。柄杆菌属（Caulobacter）仅在MDT中检出，可能与液滴提供的液-固-气三相界面有关，该属作为不对称细胞分裂和极性发育的模式生物，其在土壤中的相对丰度平均比水生环境高4倍，本研究支持这一修订后的分布模式。多个MDT富集属具有明确的生物技术应用价值：芽孢杆菌属可作为低温酶表达平台和冷区农业生物肥料；Massilia属在MDT中富集超过1,600倍，多个新种已从南极溪流、湖泊和风化层中描述；Paucibacter属具有微囊藻毒素和节球藻毒素降解能力，鞘氨醇单胞菌属（Sphingopyxis）可降解农药，提示在冰冻圈生物修复中的应用潜力；Nocardioides属、Massilia属和Mucilaginibacter属以活跃的次级代谢产物产生能力著称，具有潜在的生物医学价值。
本研究与既往MDT应用存在三点关键差异：采用2.0–2.5 μL的大体积液滴而非皮升级，有利于长期孵育稳定性和下游处理；首次在MDT培养评估中引入PacBio近全长16S rRNA基因测序，大幅提升了物种鉴定和新型分类单元界定的系统发育分辨率；首次将MDT应用于冰冻圈极端环境样本，优化了15°C低温和长达30天的孵育方案。油包水乳液结合密封特氟龙管系统有效防止了蒸发和空气真菌污染，此前数据显示该系统将5天甲醇蒸发量降至12.7%，而深孔板和摇瓶分别为86.7%和55.9%。
研究局限性包括：仅使用R2A一种培养基和好氧条件，排除了化能无机自养菌、严格厌氧菌及需特定底物的类群；未设置生物学重复；从测序检测到高阶新分类单元（如新科、新目）的物理分离仍具挑战性；液滴内可能存在混合群体，导致基于混合液滴测序的新颖性估计存在不确定性。未来可通过多培养基组合、条形码化液滴合并测序、单细胞拉曼光谱等技术实现定向靶标回收和功能筛选。研究人员还提出，在寡营养条件下竞争而非代谢合作可能是群落构建的主导力量，因此液滴隔离带来的竞争释放效应可能超过群落互作丧失的代价。高细胞输入组（DropAS_H）比低输入组（DropAS_L）表现出更高的分类新颖性，提示适度提高多细胞封装率（更高的泊松λ值）可能捕获协同微菌落或代谢互依细胞，为可控共培养提供了新方向。
结论部分翻译：本研究首次系统评估了MDT在北极活动层土壤微生物分离培养中的应用。结果表明，MDT在多项指标上显著优于CPM：回收率提高6.5至8.1倍，分离通量提升180倍，恢复的群落表现出显著更高的分类丰富度（256个属对211个属）和均匀度。近全长16S rRNA基因测序方法实现了可靠的分类学鉴定，揭示MDT恢复的序列中约50%代表潜在新物种、27%代表潜在新属。柄杆菌属（Caulobacter）及其他寡营养适应型属在MDT中而非CPM中的差异富集，凸显了液滴隔离可缓解快速生长富营养菌的竞争优势，从而释放传统培养难以获得的慢生长和稀有类群。未来研究需扩展培养基种类和孵育条件组合，同时解决菌株去重复化和从数千液滴中靶向分选的下游瓶颈。将MDT与培养组学（culturomics）和多组学整合，将加速构建全面的极地菌株资源库，推动极端条件下微生物生命的基础理解及冰冻圈资源的生物技术开发。
