低温与低微生物复杂性延缓浮游型土拉弗朗西斯菌的缓慢衰减至灭绝

《Applied and Environmental Microbiology》：A slow decay to extinction: cold temperatures and reduced microbial complexity prolong the persistence of planktonic Francisella tularensis

　　

土拉弗朗西斯菌是一种人畜共患病原体，通过接触感染动物、节肢动物媒介或被污染的环境源传播给人类。尽管其复制主要发生在真核宿主细胞内，但在宿主体外的持久性被认为对其在自然生态系统中的长期维持和传播至关重要。为了更好地理解其在哺乳动物宿主外水生栖息地的持久性，本研究在多种无菌水生条件下，研究了处于浮游状态的强毒株土拉弗朗西斯菌亚种tularensis（A型）和亚种holarctica（B型）。在寒冷、营养贫乏的处理条件下经过一年后，B型菌株（FSC200）仍能在小鼠中致病并在实验室培养基上培养，而A型菌株（Schu S4）虽能致病但发病延迟，且对实验室生长条件无响应。在持续1.5年的实验中，B型仍能使小鼠致病但发病延迟，而A型不再致病。细菌下降速率取决于亚种、温度和初始接种量。研究人员进一步探索了A型和B型种群在天然池塘水中的持久性，这证实了无菌条件下的发现，并揭示两种菌株均能从非复制性的不活跃持久状态延续疾病。本研究提供了强毒浮游型土拉弗朗西斯菌亚种tularensis和holarctica种群在不同水生条件下持久性的时间框架，有助于增进对作为兔热病延续组成部分的宿主非依赖性生存机制的理解。

研究背景

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是一种革兰氏阴性、非运动性、不形成芽孢的需氧细菌，属于弗朗西斯菌属。该属成员栖息于多种生态位，其中许多与水环境相关。作为兔热病的病原体和一种宿主相关的兼性胞内病原体，土拉弗朗西斯菌很可能由不依赖宿主的祖先进化而来，但目前只能在真核宿主细胞内或与其紧密关联的情况下进行复制。该菌因其高传染性、可气溶胶化、可用抗生素有限且易产生耐药性、以及尚无获批疫苗等特点，曾被多个国家开发为潜在生物武器，其气溶胶攻击对社会构成威胁。由于兔热病不在人与人之间传播，所有人类病例均独立地从环境源获得，因此理解该菌在环境中的持久性对于预测和控制自然人类疾病事件至关重要。

目前存在的主要问题是：尽管已知A型主要存在于北美较干燥环境并与野兔、蜱虫等相关，而B型遍布北半球并与水源密切相关，但其在环境中确切的自然循环和延续方式极难界定。缺乏关于特定避难所或疾病储存库的统一证据，以及促进哺乳动物感染事件间长期持久性的具体机制知识的缺失，使得疾病预防极具挑战性。虽然已有研究表明水生环境中的持久性是可能的，但关于不同亚种在浮游状态下具体能持续多久、受哪些环境因素影响、以及如何从非复制状态恢复致病能力等问题尚不清楚。

研究目的与意义

本研究的目的是调查浮游型持久性作为土拉弗朗西斯菌在哺乳动物感染事件间存活的一种潜在机制的时间窗口。研究人员将持久性定义为仍能导致小鼠患兔热病的细胞，并考察了这种持久性在不同水生条件（包括温度、营养可用性、盐度和细菌密度变化）下的差异。实验使用了A型和B型的完全强毒株以进行直接比较。该研究首次对强毒A型（Schu S4）和B型（FSC200）菌株进行并行比较，以评估它们在宿主限制性生态位之外、水环境胁迫条件下的持久性（以引起小鼠兔热病的能力定义）。结果有助于理解兔热病在人类和其他哺乳动物暴发之间的长期持久性机制，并为风险评估提供重要依据。

关键技术方法

1. 1.
   54周无菌孵育系统：设置八种不同处理条件，包括起始接种密度（10⁴和10⁹ CFU/mL）、温度（室温RT和4℃）、盐度（0%、0.9%、3.6% NaCl）、营养水平（寡营养、中营养、富营养）以及是否存在阿米巴原虫（Acanthamoeba castellanii）。
2. 2.
   85周无菌孵育系统：仅采用基线条件（10⁹ CFU/mL、4℃、0.9% NaCl），并使用携带gfp lux标记的工程菌株Schu S4 gfp lux和FSC200 gfp lux。
3. 3.
   天然池塘水微宇宙实验：使用来自瑞典北部河狸池塘的天然水，经0.2 μm（排除所有微生物）或200 μm（包含小型至微型浮游生物）滤膜过滤，模拟复杂微生物群落环境。
4. 4.
   检测方法：通过固体培养基培养计数（CFU）评估可培养性；通过流式细胞术测定总细胞数；通过实时定量PCR（qPCR）和叠氮溴化丙锭（PMA）结合qPCR评估细胞完整性和基因组拷贝数；通过荧光素酶活性测量代谢活性；通过小鼠腹腔注射模型评估毒力保持情况；通过16S rRNA基因扩增子测序分析细菌群落组成变化。

研究结果

1. Schu S4和FSC200均可在宿主体外持久存在超过1年

在54周实验中，两种亚种在多种水生处理条件下均能持久存在。Schu S4在三种处理、FSC200在六种处理后的接种物仍能使部分或全部小鼠患兔热病。FSC200在五种处理后仍可培养，但Schu S4在54周时均不可培养。这表明部分种群进入了活的但非可培养（VBNC）状态，小鼠模型对于识别持久性种群至关重要。在54周后仍保持毒力的处理中，FSC200的发病时间远短于Schu S4，这与FSC200的可培养性相关。持久性受高起始接种量、低温和一定盐度增强，但阿米巴原虫的存在对两种菌株的持久性无显著影响。低起始密度（10⁴细胞/mL）和室温条件均导致毒力丧失。营养添加对Schu S4不利（加速细胞损伤和毒力丧失），但对FSC200影响很小。流式细胞术显示54周后仍有完整细胞，但PMA-qPCR表明Schu S4在所有处理中均出现显著细胞损伤，而FSC200未观察到。

2. FSC200在冷水中可保持毒力长达85周

在85周延长实验中，Schu S4 gfp lux至少可延续疾病至56周但不到85周，而FSC200 gfp lux在85周时仍能使所有小鼠患病，其外部时间极限尚未确定。FSC200的可培养性在56周后消失，但85周的不可培养种群仍能致病，只是发病显著延迟。通过稀释实验估计，85周时FSC200种群中仅有约10⁴个细胞（占原始接种量的<0.01%）仍具致病能力。

3. 在含有更高多样性其他微生物的天然池塘水中，土拉弗朗西斯菌基因组等效物降解更快

在10周天然池塘水微宇宙实验中，qPCR数据显示，所有处理的基因组等效物随时间显著下降。高温（RT）和更复杂的微生物群落（200 μm滤液）显著加速了基因组等效物的减少。16S rRNA测序显示，在RT和200 μm滤液中，土拉弗朗西斯菌的相对丰度迅速下降，被复杂微生物群落取代。

4. 两种亚种在天然池塘水中均处于代谢不活跃状态

在整个10周实验期间，无论亚种、温度或滤液类型，均未在任何处理中检测到荧光素酶活性，表明细菌处于代谢不活跃状态。

5. 能致病的持久性土拉弗朗西斯菌细胞在实验室培养条件下被其他细菌竞争淘汰

所有4℃下孵育10周的接种物（无论滤液类型）均能使小鼠患兔热病，而所有RT下的接种物均不能。然而，当将这些样品接种到富营养培养基（Chamberlain培养基）中时，只有部分处理（如FSC200在4℃、0.2 μm滤液中）能恢复生长，表明在复杂微生物群落中，土拉弗朗西斯菌在体外培养时被快速竞争淘汰，但在体内（小鼠）环境下仍能成功建立感染。

讨论与结论总结

研究表明，寒冷、寡营养的自然水体若被土拉弗朗西斯菌污染，可能成为疾病延续的来源超过一年，从而实现地理区域寒冷季节的宿主体外越冬。两种亚种在天然水中均以代谢不活跃的状态持久存在，这可能使其无需与活跃微生物食物网竞争营养，从而降低被捕食风险。一旦通过染病哺乳动物尸体将大量细菌沉积到水环境中，其种群规模只能减小而不能增加，沿着一条衰减路径走向灭绝。在此路径上，细菌会经历可培养期、活的但非可培养（VBNC）期，最终完全丧失致病能力。在完全灭绝前，任何时刻通过感染新的哺乳动物宿主都有可能挽救该谱系。B型在所有实验条件下均比A型持久更长、适应范围更广，这解释了其不同的生态位和地理分布。重要的是，体外活力测定（如PMA-qPCR）并不总能等同于毒力保持，强调了使用动物模型评估风险的必要性。研究结论认为，强毒浮游型土拉弗朗西斯菌在环境中以非复制状态在一个延长时间窗口内存活是可能的，存活时间取决于局部环境，之后要么重新引入哺乳动物，要么在没有易感宿主的情况下灭绝。在这种模式下，在一定时间窗口内的重新引入对于兔热病的延续至关重要，而局部环境条件是建立地方性疾病病灶的关键。