《Analytica》：A Simple Method for Identifying Different Varieties of Honey from Yunnan, China
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摘要：本研究建立了一种基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的靶向分析方法，用于测定中国云南4种特色蜂蜜中的10种活性成分。各分析物的校准下限有所不同，范围为0.01至0.5 μg·mL?1。检出限和定量限分别为0.03–1.5 mg·kg?1
摘要：本研究建立了一种基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的靶向分析方法，用于测定中国云南4种特色蜂蜜中的10种活性成分。各分析物的校准下限有所不同，范围为0.01至0.5 μg·mL?1。检出限和定量限分别为0.03–1.5 mg·kg?1和0.1–5.0 mg·kg?1。方法的精密度、稳定性和重复性均令人满意。经偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对4种蜂蜜进行判别分析后，油菜蜜（BRH）和橡胶树蜜（HBH）聚为一类，但与草果蜜（ATH）和中华蜜蜂蜜（ACH）可明确区分。BRH与HBH可进一步通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型加以区分。龙胆酸、葫芦巴碱和柚皮素是4种蜂蜜中丰度存在差异的活性成分，而葫芦巴碱和柚皮素在BRH与HBH之间亦呈现差异丰度。火山图分析表明，高圣草酚、槲皮素和柚皮素可能是区分ACH与ATH、BRH及HBH蜂蜜的关键化合物；葫芦巴碱可能是区分ATH与HBH、ACH及BRH蜂蜜的关键化合物；槲皮素和芹菜素可能是区分HBH与ATH、ACH及BRH蜂蜜的关键化合物。
云南四种特色蜂蜜的UHPLC-MS/MS靶向鉴别研究解读
一、研究背景与意义
蜂蜜是由蜜蜂采集花蜜并经体内代谢形成的黏稠甜味液体，主要含有葡萄糖、果糖、有机酸、维生素、多酚、黄酮类等活性成分，具有抗菌、促进伤口愈合、抗氧化、抗炎、神经保护、改善睡眠、心血管及代谢调节、消化与呼吸系统保护以及美容护肤等多种生物学功效。不同蜜源植物赋予蜂蜜不同的活性成分组成，进而决定其独特的生物学健康价值与商业价值。中国是蜂蜜生产大国，常见品种包括洋槐蜜、金银花蜜、枣花蜜和百花蜜等。云南地处低纬度高原，地理环境独特，盛产草果蜜（ATH）、橡胶树蜜（HBH）、油菜蜜（BRH）和中华蜜蜂蜜（ACH）等特色蜂蜜。
然而，近年来蜂蜜市场频繁出现假冒伪劣产品，以次充好的现象屡见不鲜，仅凭外观难以有效区分不同蜜源品种。现有蜂蜜鉴别方法各有限制：分子生物学技术如定量荧光PCR和DNA条形码虽可精确鉴别蜂蜜品种，但对操作人员专业要求极高；核磁共振和稳定同位素技术需要精密仪器且分析技术难度大；近红外光谱法虽可实现快速无损鉴别，但数据需经基线校正、平滑去噪、归一化等复杂预处理；电子鼻、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）等风味化合物鉴别方法前处理简单、可获得丰富的风味信息，但数据处理工作量大；高分辨质谱非靶向筛查虽能快速获取大量化合物信息，但现有数据库难以完全支持差异化合物的结构解析，且缺乏有效的化合物确证方法。相比之下，靶向分析蜂蜜中的特征性化合物可减少数据分析工作量，是一种快速简便的鉴别途径，超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）即是此类代表性方法。
由于ATH、HBH、BRH和ACH在颜色和质地方面较为相似，仅凭外观难以有效区分，因此本研究选取这四种云南特色蜂蜜作为研究对象，旨在建立一种基于UHPLC-MS/MS的快速有效的靶向分析方法，通过测定蜂蜜中代表性黄酮类和酚酸类活性成分，实现四种特色蜂蜜的有效鉴别。
二、研究设计与技术方法
研究人员从云南省昆明市、曲靖市、玉溪市、红河州、文山州、普洱市、保山市、怒江州和西双版纳州等不同地区采集ATH、HBH、BRH和ACH蜂蜜样品各25份，所有样品均来自当地养蜂场，每份样品重1.5 kg，密封避光保存于4 °C的PTFE瓶中。研究采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，使用QTRAP 4500三重四极杆质谱仪和ExionLC AD超高效液相色谱系统，配备Kinetex XB-C18色谱柱进行分离。样品前处理采用QuEChERS方法，经提取溶剂和净化材料优化后，确定以60%乙腈水溶液为提取溶剂、C18为净化材料。数据分析采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、变量重要性投影（VIP）分析、火山图分析和热图分析等多元统计方法。
三、研究结果
3.1 提取效率比较
研究人员比较了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液和乙酸乙酯-水溶液在不同比例（0%、40%、60%、80%）下对10种目标化合物的提取效率。结果表明，随着甲醇比例增加，提取效率总体呈上升趋势，但芹菜素、金丝桃苷和高圣草酚呈相反趋势；随着乙腈比例增加，提取效率总体趋于上升，但芹菜素、葫芦巴碱和高圣草酚呈相反趋势，葫芦巴碱作为高极性生物碱在80%乙腈-水溶液中提取效率较低；乙酸乙酯含量增加时，芹菜素和葫芦巴碱的提取效率显著下降。综合比较三种优化溶剂后发现，60%乙腈-水溶液对其中8种化合物具有优良的提取效率，因此被选定为最佳提取溶剂。
3.2 净化效果比较
研究人员比较了PSA、弗罗里硅土、石墨化碳黑（GCB）、氨基（NH2）、C18、强阳离子交换（SCX）、混合模式阳离子交换（MCX）和混合模式弱阴离子交换（WAX）等8种常见QuEChERS净化材料对蜂蜜中10种化合物的净化效果。MCX的磺酸基团作为吸电子基团易吸附葫芦巴碱中的羟基，对其有较强吸附能力；WAX对忍冬苷、金丝桃苷和异槲皮苷有较强吸附，原因在于黄酮苷类通常呈弱酸性，易吸附于阴离子交换材料；GCB对金丝桃苷和异槲皮苷也有较强吸附。C18虽对金丝桃苷和异槲皮苷有一定吸附，但能有效吸附蜂蜜提取液中的非极性化合物，通过疏水相互作用有效保留色素、脂质和蜡质等弱极性干扰物质，而大多数极性较高的目标化合物几乎不吸附于该材料上，从而减轻基质干扰、减少色谱柱污染并获得可接受的回收率，因此C18被选定为最佳净化材料。
3.3 方法学验证
10种活性成分的线性范围为0.01–20 μg·mL?1，相关系数均超过0.999。检出限为0.03–1.5 mg·kg?1，定量限为0.1–5.0 mg·kg?1。精密度为2.9%–5.83%，稳定性为4.36%–6.93%，重复性为3.54%–5.61%，回收率为78.6%–97.1%，基质效应均较弱（均小于15%）。该方法具有良好的检测灵敏度和稳定性，满足蜂蜜中活性成分检测的要求。
3.4 PLS-DA和OPLS-DA判别分析
对四种蜂蜜进行PLS-DA判别分析，结果显示BRH和HBH几乎重叠，但能与ATH和ACH明确区分。该PLS-DA模型的判别能力（R2Y）为66.5%，预测能力（Q2）为66.1%，置换检验证实模型未过拟合且具有稳健性。BRH和HBH重叠的原因可能在于两者主要由中华蜜蜂（Apis cerana）生产，导致蜂蜜中的活性成分存在一定相似性。为进一步区分BRH和HBH，研究人员采用OPLS-DA模型进行二次判别分析，模型的判别能力（R2Y）为87.5%，预测能力（Q2）为85.3%，能够可靠地区分BRH和HBH。这表明对初次分类中重叠的样品采用二次OPLS-DA模型进行判别分析是一种有效的策略。
3.5 VIP分析
四种蜂蜜的VIP分析结果显示，龙胆酸、葫芦巴碱和柚皮素的VIP值均大于1，表明它们是四种蜂蜜间丰度存在差异的活性成分。此外，葫芦巴碱和柚皮素也被确定为BRH和HBH之间的差异丰度活性成分。
3.6 火山图和热图分析
火山图分析结果显示：与ATH相比，ACH中高圣草酚、4-羟基苯甲醛、槲皮素、柚皮素、葫芦巴碱和忍冬苷水平升高，龙胆酸水平降低；与BRH相比，ACH中槲皮素、柚皮素和高圣草酚水平升高，葫芦巴碱水平降低；与HBH相比，ACH中忍冬苷、槲皮素、高圣草酚、柚皮素和芹菜素水平升高；与HBH相比，ATH中槲皮素、芹菜素和忍冬苷水平升高，葫芦巴碱和4-羟基苯甲醛水平降低；与ATH相比，BRH仅葫芦巴碱水平升高；与HBH相比，BRH中槲皮素、葫芦巴碱、高圣草酚和芹菜素水平升高，4-羟基苯甲醛水平降低。
小提琴图分析进一步表明：ACH中高圣草酚、槲皮素和柚皮素水平显著高于ATH、BRH和HBH（p < 0.0001），可作为区分ACH与其他三种蜂蜜的关键标志物；ATH的葫芦巴碱含量最低，可作为区分ATH与其他三种蜂蜜的主要化合物；BRH的葫芦巴碱含量显著升高（p < 0.0001），为四种蜂蜜中含量最高，可作为区分BRH的主要化合物；HBH的槲皮素和芹菜素水平显著降低（p < 0.0001），可作为区分HBH的关键标志物。
热图分析显示，10种化合物可有效区分四种蜂蜜，四种蜂蜜可归为三类：BRH和HBH为一类，ATH和ACH各为一类，该分类结果与PLS-DA分析结果一致。
四、结论
本研究建立了基于UHPLC-MS/MS靶向测定中国云南四种特色蜂蜜中10种活性成分的方法。经提取溶剂和净化材料优化后，确定最佳前处理条件为60%乙腈-水溶液配合C18净化材料。方法学验证结果表明，该方法具有良好的检测灵敏度和稳定性，满足蜂蜜中活性成分检测的要求。通过PLS-DA判别分析，BRH和HBH几乎重叠但能与ATH和ACH有效区分；采用OPLS-DA模型可进一步区分BRH和HBH。VIP分析表明龙胆酸、葫芦巴碱和柚皮素是四种蜂蜜间的差异活性成分，葫芦巴碱和柚皮素是BRH和HBH间的差异成分。火山图分析确定了区分不同蜂蜜的关键化合物：ACH可通过高圣草酚、槲皮素和柚皮素水平升高加以区分；ATH以葫芦巴碱含量最低为特征；BRH以葫芦巴碱含量最高为特征；HBH以槲皮素和芹菜素水平降低为特征。热图分析结果与PLS-DA分析一致，证实10种化合物可有效区分四种蜂蜜。该研究为云南特色蜂蜜的品种鉴别提供了一种简便、可靠的分析方法，也为其他高度相似样品的鉴别提供了"二次OPLS-DA判别"这一有效策略。
