多组学揭示脑室周器官（CVOs）边界样微环境中不同起源且非经典表型的小胶质细胞与边界相关巨噬细胞共存

《Immunity》：Microglia with distinct origins and non-canonical phenotypes coexist within the border-like niche of the brain’s circumventricular organs

　　

脑室周器官（circumventricular organs, CVOs）是缺乏血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的小型脑区，使神经元能够直接接触血液来源信号，然而这些微环境如何塑造局部巨噬细胞的起源和表型仍不清楚。研究人员利用多组学（multi-omics）技术，对两个 CVO——最后区（area postrema, AP）和正中隆起（median eminence, ME）——的免疫景观进行了表征，揭示其具有脑边界样环境，并包含独特的巨噬细胞区室。CVO 小胶质细胞（microglia）表现出独特且异质性的表型，包括 ME 中一个受衰老（ageing）和代谢（metabolism）塑造的 CLEC7A^high 髓鞘相关亚群。CVO 小胶质细胞在个体发育起源（ontogeny）上具有多样性：胎儿单核细胞（fetal monocytes）在围产期进入 CVO，并生成长寿命的单核细胞来源小胶质细胞（monocyte-derived microglia, MO-microglia），后者完全获得卵黄囊来源小胶质细胞（yolk-sac-derived microglia）身份。清除后，CVO 小胶质细胞由局部 Sall1^high 细胞补充，但在 AP 中也由单核细胞补充。类似地，血管周 CVO 边界相关巨噬细胞（border-associated macrophages, BAMs）表现出独特的表型和起源。研究人员的发现确立 CVO 为特化免疫生态位（immune niches），塑造局部巨噬细胞，反映这些环境的免疫和代谢需求。

脑边界区域是血液与脑实质之间的通信枢纽。脑实质主要含小胶质细胞，而边界组织含多种免疫细胞，包括边界相关巨噬细胞（BAMs），其表型和功能不同于小胶质细胞：小胶质细胞表达 Sall1、Tmem119、P2ry12 和 Hexb，BAMs 则表达 Ms4a7、Apoe、Mrc1（CD206/MMR）和 Lyz2。血接触受限的边界如血管周空间和软脑膜主要含 MHC class II^low MMR^hi LYVE1^hi BAMs，而血接触广泛的边界如脉络丛和硬脑膜含 MHC class II^low 与 MHC class II^hi BAMs，后者随年龄增加。小胶质细胞和 BAMs 起源于胚胎第 9.5 天（E9.5）植入脑内的卵黄囊（YS）祖细胞。稳态下小胶质细胞通过自我更新维持，不依赖单核细胞输入；可及边界中的 BAMs 则逐渐被单核细胞替换。只有照射或长期清除小胶质细胞后，单核细胞来源小胶质细胞（MO-microglia）才定植脑内，且不能完全获得小胶质细胞签名，例如不表达 Sall1，而表达 Clec12a 和 Ms4a7。CVOs 是兼具边界和实质特征的脑实质边界区，含神经元和星形胶质细胞，但有开窗血管，因此 CVO 内小胶质细胞和血管周 BAMs 不在 BBB 后；CVO 血管周空间大，并可围绕毛细血管。CVO 分为感觉型 AP 和分泌型 ME，但尚不清楚这些微环境如何影响局部巨噬细胞的起源和表型。研究人员开展多组学研究，表征 AP 和 ME 的免疫景观，并将结果与全脑比较，发现 CVO 是脑边界样环境，含独特巨噬细胞区室。CVO 小胶质细胞表型独特且异质，ME 中存在 CLEC7A^high 髓鞘相关亚群；胎儿单核细胞在围产期进入 CVO 并完全获得卵黄囊来源小胶质细胞身份；清除后 CVO 小胶质细胞由局部 Sall1^hi 细胞重建，AP 中也有单核细胞参与；CVO-BAMs 同样具有独特表型和起源。该研究将 CVO 确立为塑造局部巨噬细胞的特化免疫生态位，反映其免疫和代谢需求，论文发表在《Immunity》。

为开展研究，研究人员采用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和高维（HD）光谱流式细胞术分析 AP、ME 及全脑的 CD45⁺ 免疫细胞；使用 Akoya Phenocycler-Fusion 和 Lunaphore COMET 进行高多重空间蛋白成像；结合 Cdh5CreER:Ai14、Flt3Cre:YFP、Ccr2CreER:Ai14、Sall1CreER:YFP、Pdgfb^ret/ret、Ms4a3Cre:Ai14 等小鼠命运图谱模型，以及 PLX3397 和 anti-CSF1R 清除模型；并进行高脂饮食、西方饮食和衰老实验。样本来源为 C57BL/6 及转基因小鼠的 AP、ME、ARC、全脑等，部分 ME scRNA-seq 使用 51 只 5–14 周龄 Flt3Cre:YFP 小鼠合并组织。

研究结果如下。第一，多组学分析揭示 CVOs 内免疫区室并鉴定小胶质细胞和血管周边界相关巨噬细胞。scRNA-seq、HD 流式和空间成像显示，AP 和 ME 含异质性免疫区室，巨噬细胞最丰富；最大巨噬细胞群 Mg1 表达 Sall1、Sparc 和 Adgrg1，Sall1^? BAM1–2 表达 Ms4a7 和 Clec12a。ME 中 BAM1 为 Siglec1⁺Folr2⁺Cd38⁺，BAM2 高表达 MHC class II 相关基因；AP 中多数 Sall1^? 巨噬细胞表达 MHC class II 基因。空间上，AP 小胶质细胞分布于实质，MHC class II^hi 巨噬细胞与开窗毛细血管相关；ME 中多数血管相关巨噬细胞为 MHC class II^? 且表达 SIGLEC1，BAM2 主要位于腹侧脑膜 ERTR7⁺ 层。CVO-BAMs 不表达 LYVE1，区别于经典血管周和软脑膜 BAMs。第二，CVO 小胶质细胞表现出区别于实质小胶质细胞的独特细胞状态。合并 CVO 和全脑数据后，AP 和 ME 小胶质细胞几乎完全与全脑小胶质细胞分离，低表达 Sall1、P2ry12、Tmem119 等经典签名基因，高表达疾病相关小胶质细胞（DAM）相关 Clec7a、Apoe、Axl，以及干扰素（IFN）相关 Ifi27l2a、Ifi204、Ifitm3。ME 小胶质细胞比 AP 更下调稳态基因并上调 IFN 相关基因。ME 中 Mg4 高表达 DAM 相关 Lgals3、Fabp5、Itgax（CD11c），Mg5 呈强 IFN 签名 Ifit3、Irf7、Cxcl10；HD 流式确认 5 个 CVO 小胶质细胞群，高表达 F4/80、CD11c 和 CLEC7A，ME 特有 CVO-MGLIA 4 高表达 F4/80、CLEC7A、CD11c、CD63 和 CD9。第三，ME 含有位于髓鞘丰富背侧区的 WAM。空间成像和共聚焦显示，ME 背侧 GFAP 富集区存在 IBA1⁺CD11c^hiCLEC7A^hiMHC class II^?Siglec1^? 分支状巨噬细胞，并与髓鞘碱性蛋白（MBP）髓鞘广泛相互作用，研究人员将其命名为 ME-WAMs，类似 Safaiyan 等描述的白质相关小胶质细胞（WAM）。衰老实验中，8 周、1 年和 2 年小鼠 ME 的 MBP 层增大，WAM 比例不变但密度降低、更分散，含 MBP 内吞物的 WAM 比例降低。高脂饮食未引起显著变化；西方饮食 12 周后 ME-WAM 丰度不变，但 LGALS3、SPP1 和 MHC class II 上调。第四，CVOs 含起源于胎肝造血的 MO-microglia。Cdh5CreER:Ai14 在 E6.5 标记原始 YS 造血后，全脑小胶质细胞和 PV-BAMs 高标记，而 AP 小胶质细胞和 CVO-BAMs 标记显著较低。Flt3Cre:YFP 显示 AP 小胶质细胞约 7%±1%、ME 约 17%±3% 为 YFP⁺，全脑仅约 0.5%；1 周龄 AP 和 ME 已有分支状 YFP⁺ 小胶质细胞，AP 中 MO-microglia 从 1 周到 3 周增加后稳定，10 周与 47 周无显著差异，CVO-BAMs 在 47 周完全单核细胞来源。Ccr2CreER:Ai14 在出生后第 0–1 天（P0–P1）标记后，AP 小胶质细胞出现标记，ME 无显著标记；在 E14.5 和 E17.5 标记胎儿单核细胞后，AP 和 ME 小胶质细胞标记显著高于全脑小胶质细胞。这些结果表明 CVO 小胶质细胞含围产期植入的胎儿单核细胞来源 MO-microglia。第五，Sall1^hi 小胶质细胞在清除和再填充后重建 CVO。Pdgfb^ret/ret 模型虽 BBB 渗漏且免疫细胞增多，但未出现 MO-microglia。PLX3397 处理 21 天可清除小胶质细胞，CVO 清除效率更高。Flt3Cre:YFP 小鼠清除后 10 天和 10 周，AP 和 ME 中 YFP⁺ MO-microglia 近乎完全丢失；ME 在 10 周时仍无 MO-microglia，AP 在 10 周时 YFP⁺ MO-microglia 重现但仍显著减少。Sall1CreER:YFP 成年标记在 CVO 小胶质细胞中较低；清除后 10 天再填充，AP 和 ME 中 YFP⁺ 小胶质细胞比例显著增加至与全脑相似，提示再填充来自 Sall1^hi 小胶质细胞，可能来自周围 ARC 和孤束核（NTS）。anti-CSF1R 抗体 AFS98 可清除 AP、ME 及周围实质的小胶质细胞，但 ME-WAMs 仅部分被清除；清除后 AP 血管中 CCL2 增加，ME 中未观察到 CCL2 增加。第六，围产期胎儿单核细胞进入 CVO 后发育为真正的小胶质细胞，而植入成年 AP 的 MO-microglia 不同。Flt3Cre:YFP ME scRNA-seq 显示，Yfp⁺ 与 Yfp^? 小胶质细胞转录等效，除 Yfp 外无差异表达基因，均表达 Sall1；Yfp⁺ 细胞均匀分布于各 ME 小胶质细胞群。成年骨髓来源 MO-microglia 在 Cx3cr1CreER:Csf1r^flox/flox 转移模型中表达 CLEC12A，而 CVO 小胶质细胞不表达 Clec12a；E17 Ccr2CreER 胎儿 MO-microglia 不表达 CLEC12A，CVO-BAMs 表达 CLEC12A。PLX 清除后 10 周 AP 重现的 YFP⁺ MO-microglia 表达 CLEC12A。结果表明单核细胞来源和进入时间决定其能否完全获得小胶质细胞身份。

讨论部分认为，CVO 是缺乏 BBB 的脑实质边界组织，含独特巨噬细胞区室。CVO-BAMs 与脑其他区域 BAMs 不同：AP 的 PV-BAMs 以 MHC class II^hi 为主，ME 的 PV-BAMs 缺乏 MHC class II 且缺乏 LYVE1；这些差异可能源于不同微环境，ME 暴露于血液和代谢信号，AP 具有哨兵作用。CVO-BAMs 逐渐被单核细胞替换，与组织可及性相关。CVO 小胶质细胞呈非稳态签名，低表达核心小胶质基因并上调疾病相关基因，可能与血液来源蛋白诱导 I 型 IFN 反应及 CVO 神经发生有关。ME 小胶质细胞比 AP 更激活，ME 具有白质样特性，ME-WAMs 局限于髓鞘富集区，衰老时髓鞘吞噬减少。CVO 小胶质细胞异质性并非由起源解释，单核细胞在各群均匀分布，并与 YS 小胶质细胞转录不可区分，表达 Sall1；而成年骨髓单核细胞不能完全获得小胶质细胞签名，保留 Ms4a7/Clec12a。胎儿肝单核细胞可在围产期自然进入 CVO 并长期存在。成年后单核细胞不再被招募，说明 BBB 缺失本身不足以驱动植入，Pdgfb^ret/ret 模型支持这一点。清除后长期再填充时 AP 出现的 MO-microglia 表达 CLEC12A，说明单核细胞来源和进入时间影响其完全获得小胶质细胞身份的能力。CCL2 在 AP 血管选择性上调，可能解释 AP 与 ME 在单核细胞趋化上的差异。局限性包括：小鼠与人 CVO 小胶质细胞的相似性尚待研究；Flt3Cre 组成型模型不能排除 CVO 小胶质细胞既往 Flt3 表达的影响；未评估在衰老时特异性清除小胶质细胞对 ME 髓鞘层的影响。研究结论为：研究人员的发现表明，CVO 微环境塑造了小胶质细胞和 BAMs 的特化、起源及自我更新，反映这些边界样实质组织的特定免疫和代谢需求。