《iScience》：Bifidobacterium adolescentis SBT2786-induced early-night sleep requires CCHamide-1 signaling in Drosophila ellipsoid body ring neuron circuits
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研究人员前期鉴定出具有促睡眠作用的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）SBT2786菌株，但其分子机制尚不清楚。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，研究人员通过组织/区域特异性RNA干扰（RNA
研究人员前期鉴定出具有促睡眠作用的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）SBT2786菌株，但其分子机制尚不清楚。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，研究人员通过组织/区域特异性RNA干扰（RNA interference，RNAi）靶向肠-脑神经肽CCHamide-1（CCHa1）及其受体（CCHa1R）。系统性CCHa1和泛神经元CCHa1R敲低消除了SBT2786诱导的早夜间睡眠增加。该表型在肠内分泌细胞（enteroendocrine cell，EEC）特异性CCHa1敲低后仍然存在，表明该效应不能完全由肠道内分泌细胞来源的CCHa1解释。区域特异性RNAi揭示CCHa1R在椭球体（ellipsoid body，EB）中是必需的，而非扇形体（fan-shaped body，FB）及所检测的多巴胺能神经元群体。环神经元驱动因子图谱分析表明EB环神经元回路（包括R3富集群体）参与SBT2786效应：使用189 years驱动因子进行CCHa1R敲低可消除该效应，而标记R2/R4m群体的驱动因子敲低则无此作用。上述发现表明，SBT2786诱导的早夜间睡眠增加需要CCHa1-CCHa1R信号传导和EB环神经元回路，且不能完全由肠内分泌细胞来源的CCHa1解释。
论文解读
一、研究背景与科学问题
睡眠障碍是重大的公共卫生挑战，对个体和社会产生广泛影响。夜间睡眠不足与日间过度嗜睡、注意力与决策能力下降、生产力降低以及肥胖、2型糖尿病、高血压和心血管事件风险增加密切相关。睡眠缺失还可能损害免疫功能并放大炎症反应，进而影响感染性和慢性疾病的进程与严重程度。在人群层面，睡眠障碍的高患病率通过降低劳动生产力、增加交通和职业事故以及提高医疗和社会保障支出，造成了沉重的经济负担。这些现状凸显了开发有效、安全且可大规模推广的睡眠干预策略的迫切性，而无需长期药物治疗的弊端。非药物干预手段——包括行为策略、生活方式调整和营养干预——作为可及的公共卫生解决方案具有广阔前景。
近年来，肠道微生物群已被确认为宿主生理（包括神经和内分泌功能）的主要调节因子，通过多种代谢产物（如短链脂肪酸和其他生物活性化合物）形成肠-脑信号传导。越来越多的证据表明，肠道微生物的组成和代谢活性可影响昼夜节律和睡眠表型。尽管进展迅速，微生物信号传递至大脑的分子机制及其神经元靶点仍不清楚。
果蝇（Drosophila melanogaster）是研究睡眠生物学和肠-脑信号传导的强大遗传模式生物。果蝇睡眠与哺乳动物睡眠共享核心组织原则，包括昼夜节律和稳态调节、特征性转录特征、药理学响应性、性别和年龄调节以及神经内分泌控制。果蝇能够实现细胞类型特异性操作和时间控制基因敲低，结合睡眠测量，使其成为阐明微生物依赖性睡眠调节的分子基础以及肠道肽与脑受体之间机制关联的有效模型。
研究人员前期鉴定出特异性菌株青春双歧杆菌SBT2786可增加果蝇睡眠时长。值得注意的是，在一项人体临床研究中，SBT2786摄入增强了夜间睡眠时长和醒来时主观满意度，支持了从果蝇到人类的转化相关性。由于肠道是乳酸菌和双歧杆菌与宿主相互作用的主要部位，感知管腔信号并向血淋巴/循环分泌肽激素的肠内分泌细胞是微生物引发脑效应的合理介导者。然而，将特定微生物刺激与大脑中明确的肽-受体通路直接关联的机制证据仍然缺乏。
在候选介导因子中，CCHa1具有独特的定位，可将肠道营养感知与觉醒和昼夜节律联系起来。在外周，肠内分泌细胞响应膳食氨基酸释放CCHa1，并向一组限定的多巴胺能神经元发出信号以调节觉醒性。在中枢，CCHa1将前背神经元1（DN1a）与小腹侧外侧时钟神经元（s-LNv）耦联，塑造晨间活动和日间午睡时间。基于这些特性，研究人员假设CCHa1通过其受体CCHa1R介导SBT2786的促睡眠效应，并试图确定CCHa1的来源——肠道来源还是神经元来源——是否驱动该表型。
二、研究目的
本研究旨在确定SBT2786如何通过CCHa1/CCHa1R信号通路调节睡眠。首先，确定该肽是在肠道内分泌细胞还是中枢神经系统神经元中产生；其次，检查受体CCHa1R是否在大脑（特别是睡眠调节中枢复合体）中发挥作用。研究人员使用RNA干扰敲低和组织/区域特异性驱动因子，评估破坏肽-受体对是否减弱SBT2786的催眠效应，旨在鉴定介导SBT2786诱导睡眠的肽激素通路，并确定肠道来源还是中枢来源的肽及其受体构成关键轴。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用果蝇Gal4/UAS二元表达系统实现组织/区域特异性基因敲低，包括RU486诱导的GeneSwitch系统进行时间控制敲低；使用TriKinetics果蝇活动监测系统（DAM2）进行睡眠行为分析，以连续5分钟以上不活动定义为睡眠；通过Scheirer-Ray-Hare检验（双因素方差分析的非参数替代方法）评估敲低与处理之间的交互效应，并采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行事后比较；使用共聚焦免疫荧光染色验证驱动因子的脑区表达模式。实验使用处女雌性果蝇（3-5日龄），在12小时光照/12小时黑暗循环下记录3天活动数据。SBT2786菌株由MEGMILK SNOW BRAND Co., Ltd.（东京，日本）提供，在Gifu厌氧培养基中培养后经离心收集、洗涤、冻干制成粉末，以1.5%（w/v）添加至含5.0%蔗糖和1.0%琼脂的对照饲料中。
四、研究结果
GeneSwitch系统性敲低表明CCHa1/CCHa1R信号通路是SBT2786促进早夜间睡眠所必需的
研究人员使用RU486诱导的GeneSwitch驱动因子将RNAi敲低限制在记录期间。通过tub5-GS-Gal4驱动系统性CCHa1敲低，在早夜间窗口（ZT12–15）检测到显著的敲低×处理交互效应：SBT2786在RU?对照中增加睡眠，而该效应在RU+敲低中被消除。使用nSyb-GS-Gal4进行泛神经元CCHa1R敲低同样在ZT12–15窗口检测到显著交互效应，SBT2786效应在RU+条件下被消除。在总夜间睡眠（ZT12–24）窗口未检测到显著交互效应，因此后续分析集中于ZT12–15。
SBT2786独立于肠道CCHa1促进睡眠，但需要神经元CCHa1
通过pros-Gal4在肠内分泌细胞中特异性敲低CCHa1，未检测到显著的敲低×处理交互效应，SBT2786在肠道CCHa1敲低后仍增加睡眠。相比之下，使用nSyb-GS-Gal4进行泛神经元CCHa1敲低时检测到显著交互效应——SBT2786在RU?条件下增加睡眠，但在RU+条件下被消除。这表明SBT2786的促睡眠效应不依赖于肠内分泌细胞来源的CCHa1，而需要神经元来源的CCHa1。
脑区特异性敲低揭示椭球体CCHa1R是必需的
使用R56H10-Gal4驱动因子在椭球体中进行CCHa1R敲低，检测到显著的敲低×处理交互效应——SBT2786在对照中增加睡眠，但在CCHa1R敲低果蝇中被消除。相比之下，在多巴胺能神经元（TH-Gal4和PAM-Gal4）及扇形体（R23E10-Gal4）中的敲低均未检测到显著交互效应，SBT2786在敲低后仍增加睡眠。这表明椭球体中的CCHa1R是SBT2786效应的必需位点，而多巴胺能系统和扇形体并非必需。
环特异性图谱分析将R3富集的椭球体回路与SBT2786效应相关联
使用标记R3富集群体的189 years-Gal4驱动因子进行CCHa1R敲低，检测到显著的敲低×处理交互效应，SBT2786诱导的早夜间睡眠增加被消除。相比之下，标记R2/R4m的驱动因子（EB1-Gal4、C819-Gal4）和标记R2的R69F08-Gal4均未检测到显著交互效应，SBT2786在CCHa1R敲低后仍增加睡眠。这表明椭球体环神经元回路（包括R3富集群体）是SBT2786效应的关键位点。
五、讨论与结论
研究结果表明，SBT2786诱导的早夜间睡眠增加需要CCHa1-CCHa1R信号通路和椭球体环神经元回路中的CCHa1R功能。该效应不依赖于肠内分泌细胞来源的CCHa1，而需要神经元来源的CCHa1。椭球体是中央复合体的组成部分，已被涉及觉醒/睡眠调节、运动控制和朝向与内部状态的整合。环神经元通常向椭球体侧方的球状体延伸树突，并在椭球体内投射轴突形成同心环。R2/R4m激活可增加睡眠，而R3d激活促进觉醒，R3m激活诱导睡眠。研究人员使用的189 years驱动因子标记R3富集群体，其CCHa1R敲低消除了SBT2786效应，而EB1、C819和R69F08驱动因子未显示此效应。
研究存在若干局限性：CCHa1/CCHa1R的必要性已证实但其充分性尚不清楚；CCHa1的来源细胞群体尚未精确定义；所用环驱动因子为椭球体富集而非单细胞类型特异性；所有睡眠分析均在处女雌性果蝇中进行，性别差异的影响尚待评估；菌株依赖性营养差异不能完全排除。
综上所述，SBT2786在果蝇中的早夜间睡眠促进作用需要CCHa1依赖性通路和椭球体中表达的CCHa1R。该效应不被肠内分泌细胞特异性CCHa1敲低所消除，表明该表型不能完全由肠道内分泌细胞来源的CCHa1解释。区域和环特异性图谱分析将椭球体环神经元回路（包括R3富集群体）与这一表型相关联，而TH/PAM多巴胺能和扇形体回路并非必需。在更多选择性椭球体神经元群体中进行亚型特异性充分性和必要性测试、CCHa1R拯救实验、鉴定上游介导因子以及提高亚型分辨率，将有助于推进对SBT2786促睡眠机制更精确的回路和分子水平模型构建。
