超低温保存技术对温室栽培香草兰（Vanilla planifolia）衍生植株蛋白质组谱的影响：D-Cryoplate（D-Cp）展现稳定的代谢重编程

《Horticulturae》：Effect of Cryopreservation Techniques on the Proteomic Profile of Cryoderived Vanilla planifolia Plants Maintained Under Greenhouse Culture Conditions

　　

超低温保存（cryopreservation）是植物种质长期保存的有效策略。然而，对超低温衍生（cryoderived）植物在离体（ex vitro）条件下的代谢响应研究甚少。本研究评估了采用液滴玻璃化（Droplet-vitrification，D-V）、D-Cryoplate（D-Cp）和V-Cryoplate（V-Cp）方法超低温保存后回收茎尖再生的香草兰（Vanilla planifolia）植株的蛋白质组谱。植株在温室条件下维持4年，并使用纳升液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）分析蛋白质表达。共鉴定出3523个蛋白质，其中1019个与非超低温保存对照植株相比显示差异表达。9个蛋白质在所有超低温保存方法中一致上调，包括查尔酮-黄烷酮异构酶（chalcone-flavanone isomerase）、葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶（Glucose-Methanol-Choline oxidoreductase，GMC）、钙网蛋白（calreticulin，CALR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、3-酮脂酰辅酶A合酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）、果胶酯酶（pectinesterase，PE）、BAHD酰基转移酶（BAHD acyltransferase）、α/β-水解酶（α/β-hydrolase）和过氧化物酶（peroxidases，POD）。这些蛋白质与胁迫保护、初级代谢、细胞壁重塑以及脂质和氮代谢相关。相反，EG45型扩展蛋白（EG45-type expansin）和含有RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRM）的参与生长调控的蛋白质观察到下调。功能富集分析显示，与非超低温保存对照植株相比，超低温衍生植株的光合能力和结构强化增强。在评估的方法中，D-Cp技术，其次是D-V技术，被证明最有效，表明超低温保存使香草兰植株在温室发育期间发生稳定的代谢重编程。

研究背景与目的
香草兰（Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews）是热带兰科植物，具有重要经济、文化和美食价值，是香兰素的主要天然来源。墨西哥，尤其韦拉克鲁斯州，被认为是该物种的主要起源和驯化中心之一。然而，野生和驯化群体面临栖息地丧失、森林砍伐、气候变化以及传统营养繁殖导致的遗传多样性有限等保护挑战；其还易感真菌病害，因此被列为需特别保护物种。长期保存香草兰种质资源成为优先策略。超低温保存（cryopreservation，利用液氮超低温长期保存生物材料的技术）是有效生物技术工具，基于液氮（?196 °C）储存，使代谢活动和细胞分裂完全停止，无需频繁继代培养，并保护材料免受不利气候、病虫害影响。已有基于液滴玻璃化（Droplet-vitrification，D-V）、V-Cryoplate（V-Cp）和D-Cryoplate（D-Cp）的香草兰茎尖超低温保存研究，但多数评价聚焦于优化冷冻保护条件和体外回收组织活力。以往香草兰蛋白质组研究仅分析液氮浸入前处理茎尖，对再生、驯化并在离体（ex vitro）长期建植后的超低温衍生植株蛋白质组信息有限。因此，研究人员表征并比较温室栽培4年的超低温衍生与非超低温保存对照植株差异蛋白丰度，并评估D-V、D-Cp、V-Cp三种超低温程序的影响。研究人员发现超低温衍生植株在初级和能量代谢、光合作用相关过程和结构过程相关蛋白丰度上不同于对照；九种蛋白在所有方法中一致上调；D-Cp表现出最独特的蛋白质组谱，被认为最有前景，其次D-V，表明超低温保存使香草兰在温室发育期间发生稳定代谢重编程。该工作为长期温室建植后的超低温衍生香草兰成年植株提供了新的分子信息，支持其适应和代谢可塑性。

关键技术方法
生物材料为温室维持4年的香草兰植株。超低温衍生植株来自体外培养茎尖经D-V、V-Cp或D-Cp程序后再生；非超低温对照来自未经超低温处理的体外茎尖，经相同体外繁殖、生根、驯化和温室建植。样本来源为墨西哥韦拉克鲁斯州Córdoba的Veracruz Tropical Ornamental Crops Company温室。取叶片，每处理6株中随机3株混合为复合样本，提取蛋白，胰蛋白酶消化，高pH反相色谱分级，nano-LC-MS/MS分析。用Proteome Discoverer v2.4、MS Amanda和Sequest HT搜索UniProt香草兰蛋白质组数据库；limma鉴定差异丰度蛋白，AgriGO v2.0/REVIGO进行GO富集，Vanilla planifolia PMN Omics Viewer分析代谢通路。

研究结果
3.1 差异表达蛋白的鉴定
蛋白质组分析共鉴定3523个蛋白质，其中D-V/Ctrl比较有1019个差异表达，D-Cp/Ctrl有936个，V-Cp/Ctrl有849个。D-V/Ctrl中510个上调、509个下调；D-Cp/Ctrl中470个上调、466个下调；V-Cp/Ctrl中430个上调、419个下调。Venn分析显示430个差异丰度蛋白为三种处理共享，D-V/Ctrl独有280个，D-Cp/Ctrl独有214个，V-Cp/Ctrl独有188个；D-V/Ctrl与D-Cp/Ctrl共享62个，D-V/Ctrl与V-Cp/Ctrl共享140个，D-Cp/Ctrl与V-Cp/Ctrl共享169个。结果表明三种超低温技术诱导部分共享和部分特有的蛋白质响应。

3.2 蛋白质组动态
火山图分析显示显著变化蛋白。D-V/Ctrl中上调蛋白包括ABHD1、CHI1、GMC、CALR、GS、KCS、BAHD-ATs-DCR、POD、PE、MATs、Saposin_B-dom；下调包括PAPs、EG45-like、RRM、TYR_Cu-bd、MFP1。D-Cp/Ctrl中上调包括CHI1、GMC、CALR、POD、PE、GS、MATs、KCS、LGMN、α/β-hydrolase family protein、BAHD-ATs-DCR、ABHD1；下调包括TYR_Cu-bd、EG45-like、TXNDC、SBT。V-Cp/Ctrl中上调包括CHI1、GMC、POD、CALR、PE、GS、KCS、BAHD-ATs-DCR、ABHD1、LOX、PLAT、Cystatin_dom；下调包括PMCA、TIP120、CAND1、PEP、TIC22-like chloroplastic、RRM。九种蛋白在三种方法中一致上调：CHI1、GMC、CALR、GS、KCS、PE、BAHD-ATs-DCR、ABHD1和POD。D-V/Ctrl与D-Cp/Ctrl共享下调EG45-like和TYR_Cu-bd；D-V/Ctrl与V-Cp/Ctrl共享下调RRM。说明共性蛋白涉及胁迫保护、初级代谢、细胞壁重塑、脂质和氮代谢，同时存在方法依赖模式。

3.3 功能富集分析
基于GO和拟南芥同源物，D-V/Ctrl鉴定38个显著生物过程，D-Cp/Ctrl 27个，V-Cp/Ctrl 23个。三种比较共有response to stress、carboxylic acid biosynthetic process和response to metal ion。D-V/Ctrl与D-Cp/Ctrl还共享nucleobase-containing small molecule metabolism、generation of precursor metabolites and energy和carbohydrate metabolic process。GO气泡图表示非冗余生物过程且不区分上调和下调。为进一步获得方向敏感解释，研究人员将蛋白log₂FC映射到UDP-sugar互变和叶绿素a生物合成途径。结果表明超低温衍生植株光合能力增强和结构强化。

3.4 代谢通路分析
UDP-sugar互变途径中，D-V/Ctrl所有检测酶丰度增加，值+0.667至+1.56，包括RmlD_sub_bind、NRS/ER、UDP-glucose 4-epimerase、UDP-glucuronic acid decarboxylase、NAD-dependent epimerase。D-Cp/Ctrl中RmlD_sub_bind、UDP-glucuronic acid decarboxylase、NRS/ER、UDP-glucose 4-epimerase、NAD(P)-dependent epimerase、UGE1增加，值+0.667至+2.00，而NAD(P)-dependent epimerase/dehydratase为负值?0.222至?0.667。V-Cp/Ctrl仅RmlD_sub_bind、NRS/ER、UDP-glucose 4-epimerase、UDP-glucuronic acid decarboxylase增加，值+0.667至+1.11。叶绿素a生物合成II中，D-V/Ctrl的coproporphyrinogen oxidase、protoporphyrinogen oxidase、Mg-protoporphyrin IX chelatase、magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester oxidative cyclase增加，值+0.267至+1.87；magnesium chelatase ATPase subunit D为负值?0.267至?0.8。D-Cp/Ctrl所有鉴定酶增加，值+0.8至+1.87，包括protoporphyrinogen oxidase、magnesium chelatase、Mg-protoporphyrin IX chelatase、magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester oxidative cyclase、chlorophyll synthase（ChlG）、geranylgeranyl diphosphate reductase。V-Cp/Ctrl中coproporphyrinogen oxidase和protoporphyrinogen oxidase增加，值+0.8至+1.33，而magnesium chelatase ATPase subunit D和NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase为负值?0.267至?1.33。说明碳水化合物/细胞壁相关和光合相关通路存在差异调节，D-Cp模式独特。

讨论部分总结
PCA显示四个实验组清晰分离，各技术内三个独立处理亚样本紧密聚类，表明蛋白质组谱不同。结果扩展了以往仅关注香草兰超低温早期阶段的蛋白质组研究。一致上调的九种蛋白涉及CALR（蛋白质稳态和Ca²⁺稳态）、POD/GMC/PE（氧化还原和细胞壁重塑）、KCS/BAHD-ATs-DCR（脂质代谢和结构组分）、CHI1（次生代谢）、GS（氮代谢）、ABHD1（α/β水解酶超家族）。CALR增加与González-Arnao et al.报道脱水阶段降低相反。POD参与H₂O₂调节和细胞壁木质化/交联；PE改变果胶性质；GMC可产生质外体H₂O₂供POD木质化。KCS参与超长链脂肪酸（VLCFAs）合成，BAHD参与角质和木栓质等修饰。CHI1参与类黄酮合成，GS参与氮同化和光呼吸铵再同化。ABHD功能多样但植物中许多成员功能未充分表征。UDP-sugars为细胞壁多糖等提供前体；叶绿素生物合成变化可能与离体生长光合调整有关，香草兰为景天酸代谢（CAM）兰花，对强光敏感。D-Cp在光合相关蛋白呈现独特模式，与先前12个月温室栽培表型趋势一致，但需进一步结合蛋白质组、生理和表型研究。方法依赖变化包括：D-V和D-Cp共享MATs增加，产生S-腺苷甲硫氨酸（SAM）；D-V还增加Saposin_B-dom；D-Cp增加LGMN和Fungal_lipase-like；V-Cp增加LOX、PLAT、Cystatin_dom，涉及脂质衍生信号、胁迫相关过程和蛋白酶解调控。下调方面，D-V和D-Cp中EG45-like降低提示细胞壁动态变化；TYR_Cu-bd降低可能反映酚类代谢改变；RRM在D-V和V-Cp降低，MFP1在D-V降低，TXNDC在D-Cp降低，提示RNA相关调节、质体组织和氧化还原过程的方法依赖性变化。总体上，这些蛋白质组和代谢响应可能涉及胁迫记忆获得、冷诱导基因表达重编程和蛋白质组动态，收敛于恢复细胞稳态、形成保护结构和激活自养光合，构成超低温衍生成年香草兰适应和代谢塑性的分子特征。

研究结论翻译
成年 V. planifolia 植株经超低温衍生并在温室条件下生长四年后，与非超低温保存对照植株相比，在与初级和能量代谢、光合作用相关过程和结构过程相关的蛋白质丰度上表现出差异。尽管三种超低温保存技术共享若干蛋白质组响应，但也观察到方法依赖性差异。在评估的程序中，D-Cp显示出独特的蛋白质组谱，其特征是与代谢和光合作用相关过程相关的蛋白质变化，提示该技术可能是 V. planifolia 种质的有前景方法。然而，需要进一步整合蛋白质组、生理和表型测量的研究，以确定这些分子模式是否与改善的植株表现相关。总体而言，这些发现为超低温衍生成年 V. planifolia 植株在长期温室建植后的蛋白质组模式提供了新的分子信息。