基于RAA联合PfAgo核酸酶系统的白腹锦鸡羽毛样本快速可视化性别鉴定方法

《Current Issues in Molecular Biology》：Development of a Rapid, Sensitive, and Visual Recombinase-Aided Amplification Combined with Pyrococcus furiosus Argonaute (RAA-PfAgo) Assay for Sex Identification in Swinhoe’s Pheasant (Lophura swinhoii)

　　

摘要

白腹锦鸡（Lophura swinhoii）成体具有显著的性别二态性。然而，幼鸟和亚成体的性别差异极小，这使得准确的早期性别鉴定对于人工繁殖和 conservation 至关重要。传统的基于PCR的性别鉴定方法需要昂贵的设备，不适合野外或基础繁殖设施使用。我们开发了一种新型重组酶辅助扩增（RAA）联合Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）核酸酶系统，靶向W连锁的EE0.6序列（EE0.6–RAA-PfAgo），利用羽毛样本提取的DNA对白腹锦鸡进行快速可视化性别鉴定。此外，还建立了一种基于UCE的RAA-PfAgo内参扩增对照（UCE–RAA-PfAgo），用于监测DNA质量和扩增成功率。最佳EE0.6-RAA反应条件为39°C持续20分钟，随后进行PfAgo介导的产物检测。整个检测流程可在50分钟内完成，结果在蓝灯下可视化判读。在稀释实验中，EE0.6–RAA-PfAgo检测法的检测限为0.65 ng基因组DNA，比传统PCR（6.5 ng）低10倍。在19份野外羽毛样本的盲测中，结果与传统PCR完全一致（符合率100%）。本研究建立了一种快速、灵敏、便捷且对设备要求极低的方法，适用于白腹锦鸡的性别鉴定，可用于野外应用和基础人工繁殖设施。