靶向星形胶质细胞富集型谷氨酸转运体GLT-1与GLAST-1的新型VHH抗体开发与验证研究

《Antibodies》：Development and Validation of Novel VHHs Targeting Astrocyte-Enriched Glutamate Transporters GLT-1 and GLAST-1

　　

摘要专业翻译 背景/目标：VHH（纳米抗体?）是骆驼科动物来源的单域抗体片段，在中枢神经系统（CNS）研究中具有广泛的应用前景，包括血脑屏障转运、病理蛋白调控及分子检测等。然而，目前针对脑内特定细胞类型靶向的VHH开发仍然有限。星形胶质细胞在CNS稳态维持中发挥重要作用，并参与多种神经系统疾病的发病过程，使其成为诊断和治疗策略中极具吸引力的靶点。本研究报道了首批靶向星形胶质细胞富集型谷氨酸转运体GLT-1和GLAST-1的VHH的开发与验证工作。方法：研究人员通过噬菌体展示技术，从骆驼科动物免疫文库中筛选获得VHH。在过表达小鼠及人源转运体的细胞系以及iPSC来源的星形胶质细胞中评估了靶点特异性和亲和力。进一步通过脑组织切片的免疫组织化学（IHC）和分散的小鼠脑细胞悬液的流式细胞术，在离体水平评估了靶点结合及星形胶质细胞特异性。VHH的体内结合能力通过脑纹状体立体定向注射进行评估。结果：1个抗GLT-1 VHH和4个抗GLAST-1 VHH在过表达小鼠转运体的细胞上表现出高特异性和表观纳摩尔级亲和力。抗GLT-1 VHH还与人源同源蛋白具有交叉反应性，这一特性已在过表达细胞和iPSC来源的星形胶质细胞中得到验证。所有VHH均在小鼠脑切片上表现出靶点结合能力，并在分散的小鼠脑细胞悬液中显示出星形胶质细胞特异性。VHH直接脑内递送后，在注射部位周围产生定位的转运体特异性信号，而非结合性同型对照VHH未产生可检测信号。结论：本研究首次报道了一组能够在体外、离体和体内选择性识别星形胶质细胞富集型谷氨酸转运体GLT-1和GLAST-1的VHH。这些VHH构成用于研究应用中星形胶质细胞检测的有力工具，且具有交叉反应性的抗GLT-1先导分子可能为未来的诊断或治疗策略（包括细胞靶向载荷递送）提供潜在价值。

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一、研究背景与科学问题

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量最丰富的胶质细胞类型，长期以来被认为仅承担结构支撑功能。然而，近几十年的研究已彻底改变了这一认识。星形胶质细胞不仅参与维持脑部架构，还通过调控脑血流量、代谢摄取和血脑屏障（BBB）维护，与血细胞密切互动；它们参与三方突触的形成与可塑性调控，保障神经递质和离子稳态，清除代谢废物，并通过胶质瘢痕形成和细胞因子释放参与损伤应答与修复。更为重要的是，星形胶质细胞与神经元协同处理信息，参与学习、记忆、行为乃至昼夜节律调控等生理过程，并可能驱动或加剧过去被认为纯粹神经元性的疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、多发性硬化（MS）、亨廷顿病（HD）及神经精神疾病等。

准确检测和表征星形胶质细胞需要可靠的分子标志物。目前常用的标志物包括GFAP、S100B、谷氨酰胺合成酶（GS）、水通道蛋白-4（AQP4）、谷氨酸转运体1（GLT-1）和谷氨酸-天冬氨酸转运体1（GLAST-1）等。其中，GLT-1（即兴奋性氨基酸转运体2，EAAT2，由SLC1A2基因编码）和GLAST-1（即兴奋性氨基酸转运体1，EAAT1，由SLC1A3基因编码）是星形胶质细胞中负责清除细胞外谷氨酸的主要转运体，对防止兴奋性毒性至关重要。GLT-1承担超过90%的突触谷氨酸清除功能，被视为泛星形胶质细胞标志物。GLT-1和GLAST-1的功能失调与多种神经系统疾病的兴奋性毒性和神经元死亡密切相关。

尽管已有多种针对GLT-1和GLAST-1的传统抗体被开发并商业化，但大多数抗体针对的是细胞内表位，这限制了其在需要结合完整非通透细胞表面天然转运体的实验技术中的应用，也限制了其治疗潜力。在此背景下，VHH（骆驼科动物重链抗体来源的单域抗原结合片段）因其小尺寸、高特异性、可溶性、组织穿透力、稳定性及易于生产和工程改造等优势，成为传统抗体的有力补充工具。然而，此前尚无针对GLT-1和GLAST-1的VHH被报道，且针对CNS内特定细胞类型靶向的VHH开发总体仍然有限。因此，开发靶向星形胶质细胞富集型谷氨酸转运体的VHH工具具有重要的科学价值和应用前景。

二、研究内容与主要结论

本研究旨在开发并验证首批靶向星形胶质细胞富集型谷氨酸转运体GLT-1和GLAST-1的VHH。研究人员通过系统的数据库挖掘策略，从公共单细胞（sc）测序数据库中筛选出在星形胶质细胞中富集、具有细胞表面表达、且在小鼠与人之间序列保守性高的候选靶点，最终选定Slc1a2和Slc1a3两个基因。通过骆驼科动物DNA免疫和噬菌体展示技术构建VHH文库，经细胞水平的生物淘选筛选出特异性结合候选VHH。研究在过表达细胞系、iPSC来源星形胶质细胞、小鼠脑组织切片及脑细胞悬液等多个层面系统验证了VHH的特异性、亲和力和星形胶质细胞选择性，并通过脑内立体定向注射评估了体内靶点结合能力。

研究得出以下主要结论：成功获得1个抗GLT-1 VHH（P00400001）和4个抗GLAST-1 VHH（P00400003/8/9/10），均对小鼠靶点表现出纳摩尔级表观亲和力；抗GLT-1 VHH与人源同源蛋白具有交叉反应性，而抗GLAST-1 VHH均不识别人类同源蛋白；所有VHH在离体小鼠脑切片和脑细胞悬液中均表现出星形胶质细胞选择性结合；脑内直接注射后，抗转运体VHH在注射部位周围产生特异性信号，而对照VHH无可检测信号。这些VHH的鉴定和验证策略（cDNA免疫、细胞水平淘选、活细胞表面结合分析）确保了其识别转运体细胞外可及区域的能力，较传统主要针对胞内表位的抗体具有显著优势，为星形胶质细胞检测、成像及潜在的靶向递送策略提供了新工具。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：①公共数据库挖掘策略，从人类蛋白质图谱（HPA）、Brain RNA-Seq和mousebrain.org等公共单细胞测序数据库筛选星形胶质细胞富集、具有细胞表面表达且跨物种保守的候选靶点；②骆驼科动物DNA免疫与VHH噬菌体展示文库构建，使用编码小鼠Slc1a2和Slc1a3基因的pVAX1质粒对一头羊驼和一头美洲驼进行四次双周DNA免疫，从外周血单核细胞（PBMCs）中回收VHH编码基因并构建噬菌粒文库；③基于细胞的生物淘选，在CHO^Slc1a2和CHO^Slc1a3稳定过表达细胞系上进行多轮筛选，GLAST-1筛选前使用HCT116^SLC1A3 KO细胞进行预清除；④流式细胞术结合分析，在过表达细胞系和新鲜分散的小鼠脑细胞悬液中评估VHH结合特异性和亲和力；⑤免疫组织化学（IHC）分析，在小鼠脑组织切片上验证VHH的靶点结合和细胞类型选择性；⑥立体定向脑内注射，将VHH直接注射至小鼠纹状体以评估体内靶点结合能力。研究使用了7-9周龄的野生型C57BL/6小鼠（雌雄兼有），以及由RESOLUTE联盟提供的HEK293 Jump In^TM T-REx^TM和HCT116人源细胞系（含野生型、敲除和过表达变体）。

四、研究结果

4.1 GLT-1和GLAST-1被选为星形胶质细胞检测的VHH靶点

通过数据库挖掘策略，研究人员从数千个基因中筛选出两个候选基因Slc1a2和Slc1a3，分别编码GLT-1/EAAT2和GLAST-1/EAAT1。这两个靶点因其在脑内高表达、强星形胶质细胞特异性（>50%表达富集）以及小鼠与人之间>90%编码序列同源性而位列候选靶点前列。

4.2 生物淘选与抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH的鉴定

研究人员构建了两个VHH噬菌体文库（美洲驼文库约1.32×10⁸ cfu，羊驼文库约2.76×10⁷ cfu），分别在CHO^Slc1a2或CHO^Slc1a3细胞上进行三轮体外筛选。筛选结果获得1个抗小鼠GLT-1候选VHH和18个抗GLAST-1候选VHH，经测序和聚类后最终获得1个GLT-1 VHH（P00400001）和8个GLAST-1 VHH（P00400003-10）用于表达和纯化。

4.3 体外抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH与小鼠及人源靶点的结合

流式细胞术分析显示，抗GLT-1 VHH特异性结合小鼠GLT-1，4个抗GLAST-1 VHH（P00400003/8/9/10）特异性结合小鼠GLAST-1，所有结合子的表观亲和力均在纳摩尔范围内。交叉反应性分析表明，仅抗GLT-1 VHH能识别人类GLT-1（在Dox诱导的HEK^SLC1A2 WT-OE细胞上验证），而所有抗GLAST-1 VHH均不识别人类GLAST-1（在HCT116^SLC1A3 KO-OE细胞上验证）。在iPSC来源的人星形胶质细胞上，抗GLT-1 VHH以单价形式未检测到结合，但以VHH:Fc双价融合形式表现出剂量依赖性结合，且信号强度与各分化批次的GLT-1蛋白表达水平相关。

4.4 抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH在小鼠脑匀浆中表现出星形胶质细胞特异性

在胰蛋白酶分散的小鼠脑细胞悬液中，100 nM抗GLT-1 VHH与>60%的星形胶质细胞（ACSA-2⁺）结合，而微胶质细胞（CD11b⁺）阳性率<10%，少突胶质细胞（O1⁺）阳性率<4%。抗GLAST-1 VHHs均与>70%的星形胶质细胞结合。在木瓜蛋白酶分散的样品中，仅抗GLT-1 VHH显示可检测结合，抗GLAST-1 VHH信号完全消失，这与GLAST-1对木瓜蛋白酶切割敏感的特性一致。对照VHH（抗β-内酰胺酶）无可检测结合，而抗MOG VHH（BBB00498）主要结合少突胶质细胞（>40%），验证了检测体系的完整性。

4.5 抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH在小鼠脑组织切片上的离体靶点结合

在野生型C57BL/6小鼠矢状脑切片上，1 μM抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH均产生广泛的神经毡样染色模式，与已知的转运体表达模式一致，包括小脑分子层Bergmann胶质细胞中GLAST-1的显著富集。与商业抗体的共染色显示清晰的共定位，证实VHH信号源于对目标转运体的特异性识别。同型对照VHH仅产生极低背景染色。

4.6 抗GLT-1和抗GLAST-1 VHH在体内的靶点结合

研究人员将抗GLT-1、抗GLAST-1（P00400009）或抗β-内酰胺酶VHH以140 μM（约5 μg）单侧注射至小鼠背内侧纹状体，24小时后收集脑组织进行免疫荧光分析。两种抗转运体VHH在注射部位周围均产生可检测的神经毡样染色信号，与离体实验结果一致；而同型对照VHH在同一时间点仅产生极低信号。对侧半球和远离注射位点的脑区未检测到VHH信号，排除了检测抗体背景的可能性。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，本研究报道了首批针对星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1和GLAST-1的VHH。研究采用cDNA免疫策略，因为这两种靶蛋白是多跨膜谷氨酸转运体，具有复杂的三级结构，传统重组蛋白生产和纯化具有挑战性。仅获得1个抗GLT-1和4个抗GLAST-1结合子，反映了针对结构复杂的膜蛋白开发亲和结合子的固有难度；小鼠与羊驼细胞外结构域的高度序列保守性（>90%）可能也削弱了免疫应答效率。所有VHH均识别转运体的细胞外可及区域，这一特性优于许多主要针对胞内N端或C端结构域的传统抗体，使其更适用于需要细胞外靶点结合的应用，包括活细胞研究、成像、功能分析以及体内诊断、治疗或靶向药物递送策略。抗GLT-1 VHH的种间交叉反应性为其临床转化潜力提供了基础，而抗GLAST-1 VHHs目前主要适用于小鼠研究。在iPSC来源星形胶质细胞中，抗GLT-1 VHH需要双价格式才能检测到内源性水平的靶点，可能与内源GLT-1表达水平较低需要亲合力效应有关。体内实验中，靶点结合可能有助于延长VHH在脑内的驻留时间，这与研究人员先前关于抗MOG VHH纳入多特异性抗体可延长CNS半衰期的发现一致。未来研究方向包括表位定位、构象状态依赖性评估、敲除模型验证、更大样本量的体内研究，以及将VHH与血脑屏障穿梭VHH（如抗TfR VHH）或治疗性载荷融合以实现非侵入性全身递送。

研究结论： 本研究描述并表征了首批针对星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1或GLAST-1的VHH，所有结合子均表现出表观纳摩尔级亲和力。值得注意的是，抗GLT-1 VHH还与人源同源蛋白具有交叉反应性，这是未来转化或临床开发的必要前提。靶点结合已在体外、离体和体内实验中得到确认，两组VHH均表现出明确的星形胶质细胞趋向性。综上所述，这些发现使所开发的VHH不仅可作为检测GLT-1和GLAST-1的稳健研究工具，还可用于星形胶质细胞鉴定。此外，抗GLT-1 VHH可能具有CNS内细胞靶向递送策略的应用潜力，以调节多种神经系统疾病背景下的星形胶质细胞功能。