《Forests》：Descriptive Assessment of Colletotrichum Overwintering in Walnut Tissues: Complementary Insights from Traditional Isolation and High-Throughput Sequencing
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理解炭疽菌属（Colletotrichum）的越冬模式对于管理核桃炭疽病至关重要。这项探索性研究将传统组织分离与高通量测序（High-Throughput Sequencing，HTS）相结合，描述了湖北省四个核桃园中该病原体的越冬分布情况。研究人员于1月（休
理解炭疽菌属（Colletotrichum）的越冬模式对于管理核桃炭疽病至关重要。这项探索性研究将传统组织分离与高通量测序（High-Throughput Sequencing，HTS）相结合，描述了湖北省四个核桃园中该病原体的越冬分布情况。研究人员于1月（休眠后期）和3月（芽萌动前）采集了芽、枝条、落叶和僵果样本，每个组织–果园–月份组合将五棵树合并为一个混合样本。传统分离鉴定出芽和落叶为回收率较高的组织，3月份回收率常超过70%。HTS揭示了更为复杂的群落组成，子囊菌门（Ascomycota）占优势，镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）和炭疽菌属（Colletotrichum）为共优势属。值得注意的是，在某果园的僵果中，HTS检出的炭疽菌属相对丰度达到40.19%；然而，由于HTS无法区分活体与非活体生物，这一结果应被解读为潜在的DNA信号，而非已确认的流行病学储库。两种方法在不同组织间呈现定性差异，这强调了传统分离检测的是可培养部分，而HTS捕获的是总DNA，其中可能包含来自非活体或不可培养来源的DNA。这些描述性发现阐明了候选的越冬生态位以及1月与3月之间的时间差异，为未来基于假设的研究提供了初步基础。研究人员建议，对可培养部分与DNA检出部分的整合分析可能有助于改进病害风险评估，但有待实验验证。
论文解读
一、研究背景与科学问题
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的木本油料作物和特色经济林树种，其坚果富含不饱和脂肪酸、蛋白质和微量元素，具有显著的经济价值。然而，随着核桃种植面积和产量的持续增长，病害暴发日益威胁产业的可持续发展。其中，由炭疽菌属（Colletotrichum）引起的核桃炭疽病是最具破坏性的病害之一，病原菌侵染叶片、果实、芽和枝条，造成叶斑、提前落叶、果实腐烂和枝梢枯死，严重降低产量和品质。迄今，中国主要产区已鉴定出17个致病种，包括C. gloeosporioides、C. fructicola和C. acutatum等，这些种具有复杂的种群结构和潜伏侵染能力，能够以菌丝形式在显症和隐症组织中越冬，成为下一生长季的初侵染源。
理解病原菌的越冬生态对于制定有效的病害管理策略至关重要。然而，现有研究存在明显不足：一方面，采用传统分离技术的区域性研究结论不一致，例如河北省报道越冬部位包括留存果和落果的果壳、果仁、果柄、芽和枝条，三门峡地区鉴定出病果、枝条、叶片和芽为关键越冬场所，而保定地区则认为枝条和落叶是主要储库。这种差异可能源于培养依赖方法的固有局限——只能检测存活且可培养的真菌，无法反映总真菌群落组成及炭疽菌属在群落中的动态。另一方面，关于不同组织间病原菌载量的时空变化定量数据明显缺乏，区域间越冬模式尚无共识。
高通量测序（High-Throughput Sequencing，HTS）具有更高的灵敏度和分辨率，能够全面剖析微生物群落。然而，将HTS与传统分离相结合研究核桃炭疽病越冬生态的尝试此前尚未开展。为填补这一空白，研究人员整合两种方法，分析了湖北省四个主要核桃园中芽、枝条、落叶和僵果在1月（休眠后期）和3月（芽萌动前）的真菌群落，提出三个假设：不同组织类型在炭疽菌属分离频率和群落组成上存在差异；炭疽菌属检出频率和群落组成在1月与3月间存在差异；培养依赖分离与ITS扩增子测序提供互补而非冗余的描述。
二、研究设计与技术方法
研究人员于2026年1月和3月从湖北省十堰市郧阳区和襄阳市保康县的四个核桃园采集样本。每个果园、组织类型和采样月份组合选取五棵树，将其组织合并为一个混合样本，共获得33个混合样本。主要技术方法包括：传统组织分离法，从每个混合样本中随机选取40个组织片段，经表面消毒后接种于PDA培养基，统计炭疽菌属分离频率；总基因组DNA提取与质量控制，采用E.Z.N.A.? Mag-Bind Soil DNA Kit提取DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和Qubit荧光计检测质量；两轮PCR扩增真菌ITS1–ITS2区域并构建文库，第一轮使用ITS1F/ITS2R引物，第二轮引入Illumina接头和样本特异性标签；Illumina平台双端测序，经Cutadapt去接头、PEAR合并、PRINSEQ质量过滤后，使用Usearch以97%相似度聚类为操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU），基于UNITE真菌数据库进行BLAST比对注释；利用Mothur计算α多样性指数，R软件进行相对丰度分析和基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）。
三、主要研究结果
3.1 传统分离揭示的组织特异性可培养炭疽菌属回收
传统组织分离证实所有采样组织中均存在炭疽菌属，且呈现明显的季节和组织特异性模式。四个果园中，芽和落叶在1月和3月均持续获得最高分离频率，3月回收率常超过70%（如厚坪果园芽76.0%，东坡果园落叶84.0%）。枝条和僵果的分离频率普遍较低且变异较大。多数组织3月的分离频率明显高于1月，例如东坡果园落叶从1月的35.7%升至3月的84.0%，芽从36.4%升至82.8%。星合果园1月落叶分离频率即达83.3%，而林科所果园回收率较为适中但仍指向芽和落叶为回收率较高的组织。
3.2 不同组织、果园和采样月份的α多样性
高通量测序共获得2,217,201条高质量序列，所有样本覆盖率指数均超过0.99。Chao1丰富度估计范围为329.29至1019.35，Shannon指数范围为1.62至4.33，Simpson指数范围为0.52至0.97。同一果园内，α多样性在1月至3月间的变化方向在不同组织间并不一致。在具备两月数据的15个组织–果园组合中，Shannon指数在8个组合中上升、7个组合中下降，无一致方向可归因于组织类型或果园。
3.3 真菌群落组成：子囊菌门优势与果园特异性模式
门水平上，子囊菌门（Ascomycota）在所有样本中占绝对优势，相对丰度均超过50%，12个样本超过90%；担子菌门（Basidiomycota）位居第二但丰度明显较低。属水平上，群落组成在不同果园间差异显著：东坡以镰刀菌属（Fusarium）、丛赤壳属（Nectria）和链格孢属（Alternaria）为前三优势属；厚坪以镰刀菌属和大茎点霉属（Macrophoma）为主；林科所以尾孢属（Cercospora）、链格孢属和炭疽菌属共优势；星合以链格孢属、未分类真菌和盾壳霉属（Coniothyrium）最丰富。作为目标病原，炭疽菌属在林科所果园3月僵果中达到空前的40.19%相对丰度，远超其他任何组织或果园；东坡落叶中从1月的2.37%升至3月的8.18%；厚坪芽中保持相对稳定（两月均约1.6%）。
3.4 1月至3月真菌群落组成的时间差异
属水平相对丰度的时间比较显示，炭疽菌属在东坡从1.90%升至2.71%，在林科所从7.87%升至11.18%（受僵果高DNA信号驱动）；而在厚坪和星合则分别从2.73%降至0.96%、从7.19%降至1.61%，表明季节动态在不同果园间并不一致。镰刀菌属在东坡（20.47%→29.57%）、厚坪（8.13%→19.73%）和星合（2.52%→5.13%）显著增加，在林科所略有下降；链格孢属在星合下降（15.75%→9.87%），但在林科所（4.84%→15.44%）和东坡（3.85%→14.62%）急剧上升。PCoA分析中前两个主坐标分别解释20.9%和9.8%的总变异，不同月份和果园的样本在排序空间中重叠明显，未呈现按采样月份的清晰分离。
3.5 传统分离与高通量测序的互补性见解
两种方法在所有完整数据样本中的炭疽菌属检出结果呈现定性差异。僵果表现出高HTS丰度但低分离频率，而部分落叶样本则呈现相反模式。在僵果和枝条中，HTS常在分离频率较低时给出较高相对丰度；而在某些落叶样本中，高分离频率与低测序丰度并存。这些对比模式表明两种方法提供互补而非重叠的信息，但由于HTS无法区分活体与非活体来源，这些差异的生物学解释仍属推测。
四、讨论与结论
讨论部分指出，传统分离鉴定出芽和落叶为回收率较高的组织，与河北、三门峡和保定等地的既往研究总体一致，表明这些组织可能提供有利的微环境——芽的封闭结构提供物理保护和营养，落叶提供大面积表面和有机质利于真菌定殖和存活。HTS则揭示了更复杂的图景，林科所果园僵果中40.19%的炭疽菌属相对丰度提示僵果可能构成此前未充分认识的炭疽菌属遗传物质储库，但这一结果仅反映序列组成优势而非活体生物量或侵染力，潜在驱动因素（组织化学特性、果园管理措施、微气候条件）均未测量。群落组成方面，子囊菌门优势与全球陆地生态系统调查一致；镰刀菌属、链格孢属和炭疽菌属的共优势仅表明DNA共存，不提供拮抗、竞争或协同作用的证据。方法学上，传统分离检测“可培养部分”，HTS捕获更全面的“DNA检出部分”，可能包含非活体细胞、休眠结构、表面附着孢子和裂解细胞释放的胞外DNA。应用层面，仅依赖HTS可能高估即时病害压力，仅依赖传统分离可能低估潜伏的DNA检出储库，整合监测框架或可提供更全面的越冬生态理解。管理建议包括：以风险为基础优先清除病枝、落叶和僵果的冬季清园；在芽萌动前针对芽组织精准施用保护性杀菌剂；通过合理修剪、控氮和抗病品种优化栽培管理；建立整合分子和环境数据的监测预警系统。
结论部分总结，该研究通过整合培养依赖与非培养依赖方法，提供了核桃炭疽病越冬生态的初步描述性认识。描述性数据提示芽和落叶为回收率较高的组织，并提出僵果在特定条件下可能构成此前未充分认识的炭疽菌属DNA来源。分离频率与测序丰度之间的定性差异凸显了区分可培养部分与DNA检出部分对准确病害预测的必要性。未来需要基于假设的研究来确定整合冬季清园、春季精准施药和微生物组监测的综合管理策略能否有效减轻核桃炭疽病，此类工作应包括纵向监测和纳入病原库动态及气象因素的预测模型，以实现精准病害防控。
