场景辐照度而非光空间分布定义小鼠昼夜节律钟的光相位重置

《Clocks & Sleep》：Photic Phase Shifts of the Mouse Circadian Clock Are Defined by Scene Irradiance Across Differences in the Spatial Distribution of Light

　　

光重置哺乳动物昼夜节律钟（circadian clock），但该反应是否仅由整合光强（irradiance）决定，还是亦受光空间分布（spatial distribution）影响，仍不清楚。研究人员测试了高对比（high-contrast）或低空间频率（low-spatial-frequency）图案是否在场景辐照度（scene irradiance）之外独立调节小鼠的昼夜节律反应。在暴露于空间图案化照明（spatially patterned illumination）后测量昼夜节律相位偏移（circadian phase shifts），包括高对比棋盘（checkerboards）和位于地平线（horizon）或天顶（zenith）的斑点刺激（spot stimuli）。在所有实验中，当配对条件之间辐照度匹配时，重新分布视野内的光未可测量地改变相位偏移幅度。昼夜节律反应可由总场景辐照度良好预测，而基于最高辐亮度（radiance）区域的指标对数据的解释较差。这些发现与小鼠昼夜节律系统对光的有效空间整合（spatial integration）一致。在所测试的空间和辐照度条件范围内，结果支持辐照度作为简单有效的指标，用于预测具有不同空间分布的光环境中的昼夜节律反应。

论文解读：

研究背景与问题方面，哺乳动物主昼夜节律钟位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nuclei, SCN），并由内在光敏视网膜神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGCs）输入进行光授时（photoentrainment），从而设定局部时间。实验与应用昼夜节律生物学通常假定，该光授时通路的活动反映环境光，并以辐照度（irradiance）或照度（illuminance）量化。辐照度指标汇总来自所有方向、落在探测器表面的光，并带余弦校正角度敏感性。这实际上纳入了场景内光空间分布不重要的假设。该实践的原因在于，环境辐照度随太阳角度变化具有难以超越的日节律信噪比；且大量跨物种研究显示，仅改变辐照度而不改变空间分布即可改变昼夜节律光反应。然而，支配SCN的ipRGCs位于眼内，每个ipRGC仅采集有限视野内的光，并非辐照度探测器，因而能够编码空间图案，SCN也继承这种能力。因此，空间分布是否额外决定昼夜节律钟对光的反应成为问题。支持忽略空间图案的证据来自全视野光脉冲研究，这些研究表明哺乳动物昼夜节律系统可在长达数分钟内整合视觉输入；在此时间框架内，视方向变化会削弱空间图案的意义。但光授时中的时间整合并不完美，对朝向锥体光感受器及精细时间尺度的刺激可失败。此外，ipRGC群体因视方向变化在空间图案上产生的未协调放电调制，可能不同于全视野照明变化引起的协调调制。实验和解剖数据还提示，视网膜某些部分可能对到达昼夜节律系统的光信号贡献不成比例，意味着自然视景中某些部分可能尤其重要。最后，至少部分ipRGC的维持放电率受视觉对比影响。先前研究显示，漂移垂直光栅可轻度增强麻醉小鼠SCN的时间平均放电，但在清醒动物中未显著影响昼夜节律相位偏移幅度；然而，该研究使用的液晶显示不能涵盖自然场景中极大的辐亮度差异，漂移垂直光栅也未捕捉自然场景随仰角变化的亮度梯度。因此，研究人员开展本研究，检验高对比图案或垂直光分布差异是否影响小鼠昼夜节律重置。

研究人员设计可向小鼠呈现定义空间图案的暴露箱。透明容器置于较大漫射Perspex箱内，外部以白和紫发光二极管（LED）阵列照明，建立均匀照明强度反应曲线。小鼠在12:12 h光暗循环（light:dark, LD）中，于活动开始后4 h（授时因子时间16，zeitgeber time 16, ZT16）接受15 min光脉冲，随后释放入恒定黑暗（constant darkness, DD）。均匀光脉冲产生相位延迟，其幅度与刺激辐照度正相关，拟合为sigmoid函数，R² = 0.63，半最大反应位于黑素蛋白等效日光（D65）照明（melanopic equivalent daylight (D65) illuminance, melanopic EDI）3.29 lx，略高于先前对等效光脉冲的报告。随后，研究人员在亚饱和范围内产生辐照度匹配的棋盘与无特征照明、地平线或天顶斑点刺激。结论是，空间再分布光未改变相位偏移幅度；总场景辐照度能良好预测昼夜节律反应，而最高辐亮度区域指标预测较差。这支持辐照度作为简单有效指标，用于跨空间分布不同的光环境预测昼夜节律反应。

为开展研究，作者用到的主要关键技术方法可概括为：采用成年雄性C57BL/6J背景小鼠（Envigo, Belton, Loughborough, UK），10–12周龄，单笼饲养并配跑轮，先于12:12 h LD循环中适应至少两周。于ZT16将小鼠转入定制光暴露装置，给予15 min光脉冲，随后返回笼中于DD记录跑轮活动10天。光暴露装置为15 cm透明Perspex容器，置于75×75×110 cm漫射opal Perspex箱内，外部以紫光和白光LED照明，光谱近似晴空日光。棋盘图案通过在外箱表面放置0.9中性密度胶形成，空间频率0.044 cycles per degree (cpd)；斑点由白LED和紫LED产生，置于地平线或天顶。相位偏移通过活动起始线手工拟合并由盲法评分，比较采用配对t检验，分析使用MATLAB R2022a和GraphPad Prism 10。样本来源为C57BL/6J背景小鼠。

研究结果部分，保留原图题所述小标题并浓缩如下。“光箱与辐照度依赖性昼夜节律相位重置”显示，13只小鼠接受0.025至397.65 lx melanopic EDI均匀光，相位延迟与场景辐照度正相关，四参数logistic拟合R² = 0.63，半最大反应为3.29 lx melanopic EDI，略高于先前报告。“光的空间再分布不改变昼夜节律相位重置”显示，棋盘1暗区比亮区宽3倍，亮占空比25%，最大辐亮度为12.32 log₁₀(melanopsin-effective photons cm^?2 s^?1 sr^?1)，辐照度4.16 lx melanopic EDI；棋盘2暗区比亮区宽7倍，亮占空比12.5%，最大辐亮度相同，辐照度2.10 lx melanopic EDI。棋盘1中，棋盘与辐照度匹配均匀光的平均配对差为21.6 min（95% CI ?11.1至54.2 min；配对t检验，t(13) = 1.43，p = 0.18）；棋盘2中平均配对差为8.8 min（95% CI ?14.6至32.1 min；t(9) = 0.85，p = 0.42）。地平线与天顶斑点比较中，13个完整配对，平均配对差为3.0 min（95% CI ?22.8至28.9 min；t(12) = 0.26，p = 0.80）。峰值辐亮度分析显示，棋盘2和两个斑点刺激的平均相位偏移幅度落在均匀照明辐亮度反应曲线的95%置信区间之外，说明峰值辐亮度不是昼夜节律反应的充分预测指标。

讨论部分总结认为，能否确信光空间分布从不对小鼠昼夜节律反应有意义，取决于所用刺激覆盖小鼠可能遇到图案的程度。本研究中图案刺激的场景内辐亮度范围应超过多数自然场景；斑点刺激覆盖了与太阳高度变化相关的垂直维度最亮区域极端，但任何实验室刺激都不能再现直射太阳的点源辐亮度。因此，结论可能适用于多数自然发生的亮度图案。研究人员未探索颜色图案，也未覆盖白天预期光强；在极亮环境或极亮点源如太阳下，空间总和规则可能不同，但小鼠昼夜节律反应通常在黄昏辐照度即饱和，故这更偏理论考虑。向成年雄性C57BL/6J小鼠之外推广仍未知：性别和激素状态、品系、时间生态位均可影响光相位偏移、再同步或ipRGC分布，是否影响光授时中的空间整合尚不清楚，需要跨性别、遗传背景和物种的匹配功能比较。关于空间平均如何实现，非哺乳动物可能使用本身不方向敏感的光感受器；哺乳动物ipRGCs位于视网膜，各自采样不同视景，SCN神经元对视觉刺激位置反应不同。空间平均可能通过时间整合实现，头部和眼动使每个ipRGC经历大范围视野，黑素蛋白光转导的慢时间分辨率可模糊高空间频率图案，SCN网络内过程也可能贡献。自然视方向变化可能不足以让单个ipRGC忠实代表整个视景，例如背侧视网膜ipRGC偏好下视野；时间平均也不足以克服视觉对比对ipRGC维持活动的影响。因此，可能需要SCN生理或解剖特征来解释粗图案的有效空间整合。研究结论部分翻译为：研究人员的数据支持继续将辐照度作为昼夜节律生物学中简单有效的光指标。因此，没有任何图案化刺激反驳相位偏移幅度可由场景辐照度良好预测这一简约假设。这是一个重要结论，因为辐照度指标提供了一种简单方式，将实验条件（其中空间图案常被明确最小化）与图案不可避免的自然条件，以及在光分布非常不同的场景之间关联数据。原则上，其他指标可能提供更可靠拟合，研究人员的数据可用于检验替代提议。此处仅检验一个替代假设，即昼夜节律反应根据最高辐亮度区域缩放。研究人员发现这不能充分预测相位偏移幅度。该结论的一个限制是，空间图案当然会使辐照度测量取决于探测器指向，因此仍须充分描述实验和干预研究中的光空间分布，并在测量时考虑受试者的主要视角。