共识引导优化鸭胚胎水解物中的肽模板获得抗菌肽AKS12

《Food Bioscience》：Consensus-guided optimization of a peptide template from duck embryo hydrolysate yields the antibacterial peptide AKS12

　　

摘要
食品蛋白水解物为开发生物活性成分提供了多种多样的肽模板，但许多天然鉴定的序列活性不足，无法直接应用。在本研究中，我们从鸭胚水解物中优先选取了一个肽模板，使用八模型共识面板进行优先级排序，并用HydrAMP进行优化。合成并评估了APK10以及两个排名较高的衍生物AKS12和AKK11-2的抗菌活性、构象行为、对热、pH和血清预处理的耐受性、红细胞兼容性、细菌表面效应和膜相互作用。APK10对测试菌株的最低抑菌浓度（MIC）值>1024 μg/mL。AKS12对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为64 μg/mL，对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的MIC值为128 μg/mL，而AKK11-2尽管获得了8/8的共识支持，但抗菌活性有限。AKS12在热、pH和血清预处理后仍保持生长抑制活性，并显示出良好的红细胞兼容性。扫描电镜显示AKS12处理后的细胞表面变形，300 ns全原子分子动力学模拟表明AKS12在阴离子磷脂双分子层界面上有更深局部化的趋势，与AKK11-2相比，脂质堆积、酰链有序性和横向流动性变化更大。这些发现表明，共识筛选和模板约束重新设计可以将低活性的食品来源肽模板转化为功能改进的衍生物，而膜界面行为（而非预测得分或α螺旋倾向）与实验测量的抗菌活性相关。这项工作为从食品来源的肽资源开发抗菌肽提供了实用框架。

引言
食品蛋白水解物含有大量序列多样的短肽，是开发食品来源生物活性成分的重要资源。LC–MS/MS和肽组学的进展使得从复杂水解物中快速鉴定大量肽成为可能；然而，只有少数比例的这些序列通常表现出可测量的功能活性。传统的基于顺序分级、纯化、合成和活性测试的筛选方法耗时且可能无法覆盖低丰度序列及其潜在功能性衍生物。抗菌肽（AMPs）已成为食品来源肽研究的重要焦点，因为其序列可设计性和控制食品相关微生物的潜力。然而，在复杂的肽库中鉴定同时具有抗菌活性、耐热性、耐pH和血清预处理以及生物相容性的候选物仍然具有挑战性（Corrêa等，2023；Qin等，2022）。以前从鸭胚蛋白水解物中鉴定出具有抗氧化或酶调节活性的肽，表明鸭胚蛋白可能为食品来源功能肽提供有用的序列资源（He等，2019；Peng等，2022）。

AMPs的生物学功能通常由净电荷、疏水性、两亲性、芳香残基分布和环境诱导构象的综合效应所决定。阳离子残基，如赖氨酸（Lys）和精氨酸，可以促进肽对带负电细菌表面的初始静电吸附，而疏水和芳香残基则促进界面锚定和进入脂质区域。然而，这些特性必须保持适当平衡。增加正电荷或疏水性可能会增强膜亲和力，但过高的疏水性或连续的疏水表面也可能增加红细胞溶血和非特异性膜损伤。即使具有相似净电荷和α螺旋倾向的肽，也可能因为疏水矩、带电残基的角度分布、芳香残基定位和膜界面取向的差异而表现出明显不同的抗菌活性（Gagat等，2024；Magana等，2020；Matsuzaki，2009）。因此，从鸭胚水解物中鉴定的肽模板的有限序列优化不应专注于增加单一的物理化学参数，而应综合考虑膜吸附、界面定位、构象兼容性和细胞选择性。

计算预测和生成序列设计为从复杂肽库中优先选择候选物提供了有用的支持。现有的AMP预测器使用不同的数据集、负样本定义、序列描述符和机器学习算法进行训练，因此可能对同一候选序列赋予不一致的标签。独立基准研究也表明，基于网络的预测工具的性能受测试集组成、肽长度、序列同源性和所选评价指标的影响（Gabere & Noble，2017；Xu等，2021）。多个模型的多数投票可以减少候选物优先级排序对任何单一算法的依赖（Wu等，2023）。然而，由于不同的模型可能共享相关的训练数据或特征系统（Xu等，2021），共识结果仍然是序列水平的计算证据，不能替代对抗菌活性和安全性进行实验评估（Szymczak等，2023）。在食品来源肽研究中，计算工具应主要用于缩小候选空间、比较物理化学性质和制定可实验验证的假设，而不是将预测标签与实际生物功能等同起来（Rivero-Pino等，2023）。在此基础上，如HydrAMP等深度生成模型可以探索给定模板周围的局部序列空间，并为低活性天然肽的目标优化生成候选衍生物（Szymczak等，2023）。

以前的研究表明，电荷、疏水性或关键残基的修饰可以改善低活性天然AMPs的抗菌性能（Mwangi等，2023；Ouyang等，2022）；然而，计算得分的提高并不一定转化为可测量的实验活性（Hazam等，2023）。一个关键未解决的问题是，为什么具有相似预测支持、阳离子特性和膜诱导α螺旋倾向的设计肽可以表现出明显不同的抗菌活性。肽自缔合和聚集可以影响膜相互作用，表明活性并不总能从孤立的肽分子本身来理解（Melcrova等，2023）。此外，一些AMPs对细菌细胞发挥多种作用，将膜扰动与破坏细胞过程如能量代谢和氧化平衡相结合（Choi等，2017）。抗菌结果也可能取决于细菌代谢状态和测定条件，包括氧气可用性、培养基组成和接种物密度（Choi等，2017；Loffredo等，2021）。在这一更广泛的背景下，膜界面行为仍然是需要研究的重要方面。基于序列的预测器主要识别已知AMPs中存在的统计模式，无法直接描述肽在膜界面的取向、残基定位、锚定深度或脂质重组（Tsai等，2022；Xu等，2021）。阳离子残基可能决定肽是否能够接近阴离子膜，而芳香和疏水残基的空间排列可能进一步控制界面驻留和部分膜插入（Huan等，2020；Matsuzaki，2009）。因此，对具有相似预测支持但不同实验活性的衍生物进行平行比较可能有助于区分一般的AMP样序列特征与可以转化为可测量抗菌功能的膜界面特征。我们因此假设，食品来源肽模板优化后获得抗菌活性不仅取决于共识预测得分、净电荷或α螺旋倾向，还取决于带电、芳香和疏水残基在膜界面的协同定位。

在本研究中，我们从鸭胚水解物中鉴定的APK10被用作天然肽模板。应用预先指定的八模型多数投票面板来优先选择含有10-25个氨基酸残基的候选序列，随后使用HydrAMP进行模板约束的序列优化。AKS12和AKK11-2获得了同样强烈的共识预测支持，但在物理化学性质上有所不同，它们被合成并与APK10平行评估，以确定序列优化是否可以转化为可测量的抗菌活性。比较了三种肽的环境诱导构象和功能特性，进一步评估了AKS12在热、pH和血清预处理后的生长抑制活性及其红细胞兼容性。然后使用扫描电镜（SEM）和全原子分子动力学（MD）模拟来比较AKS12和AKK11-2的膜界面定位及其对阴离子1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油酸（POPG）双分子层组织的影响。本研究旨在建立天然食品来源肽模板、序列优化和可实验测量功能之间的联系，并从膜界面行为的视角解释为什么高度排名的设计衍生物可能表现出不同的抗菌活性。研究结果提供了优化食品来源肽模板抗菌功能的基础，并为其在食品相关应用中的后续评估提供了依据。整体研究设计如图1所示。

部分片段
材料和方法
肽APK10、AKS12和AKK11-2由GL Biochem Ltd.（上海，中国）合成。Mueller–Hinton肉汤（MHB）和琼脂购自北京博奥星生物科技有限公司（北京，中国）。2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）购自北京莱根生物科技有限公司（北京，中国）。2,2,2-三氟乙醇（TFE）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国），十二烷基硫酸钠（SDS）

共识筛选识别APK10作为可优化的肽模板
食品蛋白水解物含有大量序列多样的短肽，其功能大部分未被表征，其中只有少数比例预计具有可测量的生物活性。为了提高实验筛选效率，从鸭胚水解物中衍生的肽库首先通过序列长度进行过滤，然后对AMP候选物进行基于共识的优先级排序。合并、清理和去重后，之前报道的

结论
本研究结合共识优先级排序、HydrAMP重新设计和实验验证来优化从鸭胚水解物中鉴定的肽模板APK10。APK10对四种测试细菌菌株的MIC值>1024 μg/mL，而AKS12的MIC值为64-128 μg/mL；排名相似的衍生物AKK11-2抗菌活性有限。AKS12在热、pH和血清预处理后仍保持生长抑制活性，并显示出低红细胞

作者贡献声明
Xingyue Jiang: 原创草稿撰写、资源、方法论、数据整理。Xinlan Zhuo: 审稿与编辑、资源、方法论。Zhiyu Chen: 方法论。Shaojie Zhang: 资源。Guizhao Liang: 监督、资金获取、概念化。

伦理声明
本研究按照以下动物福利和/或报告准则进行：《实验动物-动物福利伦理审查指南》（中国 GB/T 35892-2018）。本研究获得了重庆大学生物医学伦理委员会的批准。

利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本论文所述工作的竞争经济利益或个人关系。

致谢
本研究得到重庆市科技创新与应用发展重点项目（CSTB2024TIAD-KPX0014）和国家自然科学基金（编号：32172196）的支持。

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