肝微粒体香豆素代谢中的物种差异：11β-羟类固醇脱氢酶 1 型的作用

《Food and Chemical Toxicology》：Species Differences in Hepatic Microsomal Coumarin Metabolism: A Role for 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1

　　摘要香豆素曾作为食品添加剂使用，如今因肝毒性风险而受到广泛限制。香豆素诱导的肝毒性归因于其活性代谢产物邻羟基苯乙醛（o-HPA），但负责将o-HPA解毒为邻羟基苯乙醇（o-HPE）的微粒体酶尚未被鉴定。本研究旨在确定参与o-HPA解毒的关键微粒体酶，并评估大鼠与人类在香豆素代谢和毒性方面的差异。我们合成了o-HPA，并在HepG2细胞中评估了其在微粒体中的代谢和细胞毒性。7-羟基香豆素是人肝微粒体（HLM）中的主要代谢物，而大鼠肝微粒体则显示出更多的o-HPA积累。o-HPA在HLM中的固有清除率大约是人肝微粒体的五倍，表明人类具有更高效的微粒体解毒作用。o-HPA比香豆素及其代谢物表现出更高的毒性。重组11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）催化了o-HPA向o-HPE的还原；使用抑制剂18β-甘草次酸进一步评估了11β-HSD1的参与。该抑制剂在HLM中显著抑制了o-HPE的形成，并以剂量依赖性方式增加了香豆素在HepG2细胞中诱导的细胞毒性。这些发现确定11β-HSD1是参与o-HPA解毒的关键微粒体酶，同时也是活性醛类代谢物微粒体解毒物种差异的潜在决定因素。引言香豆素（1,2-苯吡酮）是一种从香子兰豆中分离出的天然化合物，因其类似香草的香味而在消费产品和食品中广泛使用。在饮食中，香豆素天然存在于水果、蔬菜、植物油（橄榄油、大豆油、玉米油）、咖啡、坚果、葡萄酒和茶叶中，其中肉桂含有相对较高含量的香豆素，使其成为重要的膳食暴露来源。除了嗅觉应用外，香豆素及其衍生物如华法林可抑制凝血级联反应，这促使其被开发为抗凝药物。历史上，香豆素化合物曾被用于前列腺癌、肾细胞癌和白血病的临床治疗。早期研究报告称，在两周至两年以上的时间内，向数千名参与者给予100至7,000 mg/天的治疗剂量。近期研究表明，香豆素还具有抗炎活性，使其成为治疗类风湿性关节炎、哮喘和炎症性肠病的潜在候选药物。此外，香豆素化合物在多种疾病中展现出治疗潜力，包括自身免疫性疾病、癌症、病毒感染和结核病。尽管香豆素使用广泛且存在膳食暴露，但由于其肝毒性，香豆素的直接使用在美国（21 CFR 189.130）和欧洲（条例EC 1334/2008）受到限制。2004年，欧洲食品安全局确定了香豆素的每日允许摄入量为每天每公斤体重0.1 mg。欧盟还针对某些含有肉桂作为调味成分的复合食品设定了最高允许限量，因其含有相对较高的香豆素。在大鼠中，长期以超过最大耐受剂量（5,000 ppm）的香豆素水平进行膳食给药，会导致胆管癌和肝实质细胞肿瘤的发生率增加。然而，估计的膳食和化妆品来源对人类每日香豆素暴露量约为0.06 mg/kg/天——比引起大鼠肝脏肿瘤的剂量低3,900倍以上。因此，在这些低水平下，香豆素通常被认为对人类是安全的，但对大鼠可能具有毒性。这种毒性差异主要是由于物种依赖的代谢途径所致。在人类中，香豆素主要由细胞色素P450 2A6（CYP2A6）代谢为7-羟基香豆素（7-HC），这是一种无毒代谢物，对香豆素具有高容量和高亲和力。口服香豆素后，7-HC及其葡萄糖醛酸或硫酸结合物占尿液代谢物的68–92%。相比之下，大鼠CYP2A酶更倾向于催化睾酮的7α-羟基化而非香豆素，导致7-HC的形成极少。在大鼠中，香豆素被氧化为一种活性中间体香豆素3,4-环氧化物，该中间体可与谷胱甘肽（GSH）结合，或在释放CO?的情况下发生非酶促重排，形成邻羟基苯乙醛（o-HPA）。o-HPA等醛类物质具有反应活性，可能导致蛋白质交联，从而引起肝毒性。因此，香豆素诱导的肝毒性物种差异归因于代谢差异，o-HPA被确定为关键代谢物。o-HPA形成后，通过醛脱氢酶氧化为邻羟基苯乙酸（o-HPAA）或通过还原为邻羟基苯乙醇（o-HPE）在肝细胞质中进行解毒。o-HPA是通过CYP介导的氧化在内质网（ER）内生成的；因此，一种局部化的代谢防御机制可以立即中和这种活性中间体，使其在扩散到细胞质之前被消除。然而，负责肝微粒体中o-HPA代谢的酶尚未被鉴定。11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）是短链脱氢酶/还原酶超家族的一员，在多种组织中表达——包括肝脏、脂肪组织、血管和大脑——其中它调节皮质醇的产生。在肝微粒体中，11β-HSD1在羰基化合物的解毒反应中起关键作用。因此，在本研究中，我们评估了o-HPA——一种活性香豆素代谢产物——在人和大鼠肝微粒体中的代谢和毒性，以阐明香豆素代谢的物种差异。具体而言，我们调查了11β-HSD1在o-HPA代谢中的机制作用，以确定该酶是否参与了微粒体o-HPA的解毒。首先，使用o-HPA的纯品标准品在细胞毒性和代谢实验中确认其反应活性。然后在人肝微粒体存在的情况下，在人HepG2细胞中评估o-HPA的细胞毒性和代谢。接下来，使用混合人肝微粒体（HLM）、大鼠肝微粒体（RLM）以及重组酶（包括人CYP亚型和黄素单加氧酶（FMO）亚型）对香豆素和o-HPA进行定量分析和反应表型分析。最后，使用重组11β-HSD1及其抑制剂来确认参与o-HPA代谢的微粒体酶。化学物质与试剂香豆素、o-HPAA、o-HPE、卡马西平、氯噁唑酮、葡萄糖-6-磷酸（G6P）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式（NADPH）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式（NADP?）、甲酸、氯化镁（MgCl?）、氯化钾（KCl）、二甲基亚砜（DMSO）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）和18β-GA均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）香豆素在培养肝微粒体的HepG2细胞中的细胞毒性为研究香豆素诱导的细胞毒性，我们用不同浓度的香豆素处理HepG2细胞。半最大致死浓度（LC??）值由八浓度-反应曲线确定（图1A）。香豆素的LC??值（95%置信区间）为5.07 mM（3.91–6.56 mM）。为确定人肝微粒体代谢对香豆素诱导毒性的影响，在存在或不存在的情况下用香豆素和0.375 mg/mL HLM处理HepG2细胞讨论香豆素诱导的肝毒性最早在60多年前被描述。此后，香豆素诱导的肝损伤物种差异促使人们在体外和体内对香豆素代谢进行了广泛研究。虽然香豆素诱导的肝毒性在人类中不常见，但临床研究报道了少数接受香豆素治疗的患者出现转氨酶水平升高。在人类中，香豆素主要由CYP2A6代谢为7-HC，而大作者贡献声明郑尚苏：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法论、调查、形式分析、概念化。郑泰元：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法论、调查、形式分析、概念化。李诺比：调查、形式分析。费翔：调查、形式分析。徐承永：审稿与编辑、项目管理、方法论、资金获取。利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能对本研究产生影响。数据可用性数据可根据要求提供。利益冲突声明? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能对本研究产生影响。致谢本研究由韩国政府资助的韩国国家研究基金会（RS-2024-00349194，资助金尚基姆）以及基础研究计划（RS-2020-NR049589，资助费翔和徐承永；RS-2025-25397599，资助金尚基姆）资助。资助方与研究设计、数据收集、分析与解释、报告撰写以及提交论文发表的决策无关。郑泰元 | 郑尚苏 | 费翔 | 李诺比 | 吴秀真 | 徐承永 | 金尚基姆