《Current Opinion in Structural Biology》：Single-molecule fluorescence methods for visualizing the central dogma
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荧光显微术长期以来一直是观察细胞和组织内生物现象的强大工具。在此，研究人员讨论了固定样本和活细胞成像方法的最新进展，以在单分子水平上可视化中心法则。
荧光显微术长期以来一直是观察细胞和组织内生物现象的强大工具。在此，研究人员讨论了固定样本和活细胞成像方法的最新进展，以在单分子水平上可视化中心法则。
单分子荧光成像技术解码生命中心法则的研究解读
一、研究背景与问题提出
人类基因组由约三十亿个碱基对组成，编码近两万个执行细胞功能的蛋白质编码基因，其余非编码基因组则包含调控基因组表达与折叠的元件。非编码转录本在调控细胞过程中也日益受到重视。不同细胞类型如何利用和传递这些信息，对决定细胞命运和疾病发生具有重要影响。因此，理解DNA、RNA和蛋白质如何在中心法则所描述的信息有序流动中协同运作，是生物医学研究的基础。
表观基因组学、转录组学和蛋白质组学旨在解析不同细胞和组织类型中的模式与复杂性。基于测序的批量分析方法提供了基因组组织和基因表达的宏观视角，但无法揭示单个细胞内的空间组织和动态行为。单分子荧光成像方法能够在完整的固定或活细胞及组织内直接可视化生物分子，为整合理解中心法则提供了独特窗口。然而，如何在同一细胞中同时检测DNA、RNA和蛋白质，并克服不同生物分子标记条件之间的兼容性问题，仍是该领域面临的核心挑战。
二、研究内容与主要结论
本综述系统总结了单分子荧光成像技术在中心法则研究中的最新进展。研究人员指出，寡核苷酸合成探针的引入是DNA和RNA成像的关键突破。Oligopaints技术重新定义了单分子DNA的概念，使检测分辨率达到2-10 kb至30 kb的水平。在RNA成像方面，MERFISH通过16位纠错条形码方案实现了130种RNA的稳健检测，而最新的RT&T-AMP-MERFISH技术已能在小鼠脑组织切片中空间定位约23,000个基因和约10,000种异构体的表达。在蛋白质成像方面，寡核苷酸偶联抗体的策略使CODEX实现了46-60种蛋白质的高度多重检测，而DNA-PAINT及其衍生技术如SUM-PAINT和FLASH-PAINT则实现了纳米级分辨率的单分子蛋白质成像。
活细胞成像方面，CRISPR-Cas9系统的应用使研究人员能够追踪几乎任意基因组位点的动态行为。Oligo-LiveFISH通过将荧光标记连接到tracrRNA上，显著降低了背景信号，并揭示了增强子-启动子相互作用的受限运动模式。在RNA活细胞成像中，CRISPR-Csm系统实现了约80%效率的内源RNA追踪。蛋白质活细胞成像方面，自标记标签（SNAP、Halo）结合Janelia Fluor染料系列，使单分子追踪达到前所未有的时空分辨率，MINFLUX技术更是实现了纳米级精度和毫秒级时间分辨率的蛋白质动态监测。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下核心技术方法：基于寡核苷酸合成的Oligopaints探针用于DNA和RNA的荧光原位杂交（FISH）标记；基于条形码编码和连续成像的多重空间组学技术（MERFISH、seqFISH+、CODEX）；基于DNA-PAINT的单分子定位超分辨显微术及其多重化变体（SUM-PAINT、FLASH-PAINT、tkPAINT）；基于CRISPR-Cas9/dCas9的活细胞基因组位点标记系统（Oligo-LiveFISH）；基于MS2-PP7茎环系统和CRISPR-Csm的活细胞RNA追踪技术；自标记蛋白标签（SNAP-tag、HaloTag）结合Janelia Fluor染料进行单分子蛋白质追踪；MINFLUX光子高效定位技术；以及扩展显微镜技术（ChromExM、SCEPTRE）用于固定样本的多重标记成像。
四、研究结果
固定样本中的单分子中心法则图谱： 在DNA成像方面，Oligopaints结合超分辨显微术实现了单基因压缩程度的测量和增强子-启动子间物理距离的解析。对SOX9位点的研究表明，群体平均差异源于常见拓扑结构频率的变化，揭示了基因组拓扑的概率性本质。RASER-FISH应用于染色质示踪实验，为有丝分裂染色体的嵌套环结构和物理排斥模型提供了空间证据。在RNA成像方面，MERFISH在组织中的应用揭示了细胞类型特异性基因表达模式及其在天然组织环境中的空间分布。RT&T-AMP-MERFISH的空间异构体表达模式可能有助于理解疾病相关异构体如何表现为患者症状。在蛋白质成像方面，多重DNA-PAINT成像发现溶酶体形成具有不同膜蛋白组成的细胞类型特异性亚群；神经元空间蛋白质组的单蛋白分辨率成像发现了一种新型突触亚型，其特征为抑制性突触的突触后支架与兴奋性突触前囊泡池的组合。
活细胞中的单分子中心法则图谱： 在DNA动态成像方面，Oligo-LiveFISH标记增强子和启动子时，检测到与基因表达相关的受限运动模式。在RNA动态成像方面，CRISPR-Csm系统追踪两种不同转录本时揭示了独特的定位和运动模式，可能与其翻译、功能和细胞内寿命相关。在蛋白质动态成像方面，MINFLUX技术实现了活细胞中驱动蛋白步长的直接测量，并揭示了核孔复合体的双向运输发生在中央孔道重叠区域，表明不同运输途径无需避免无效碰撞和对向运动。
五、结论与展望
细胞是DNA、RNA和蛋白质的密集聚集体，通过复杂的时空调控相互作用发挥功能。下一前沿是将中心法则作为整合实体而非孤立过程进行研究。固定样本中，DNA seqFISH+实现了100,000多个DNA位点、数万个RNA和60多种蛋白质的组合标记。扩展显微镜技术如ChromExM已在斑马鱼合子基因组激活过程中同时检测中心法则的全部三种组分。活细胞研究中，Wiggan和Stasevich通过CRISPR对MYH9基因座进行连续改造，同时读出单细胞中的RNA和蛋白质水平，发现了应激依赖性的"翻译缓冲"现象。研究人员预计，通过组合标记和成像技术，将有望在不久的将来解析相分离和环挤压等转录调控机制如何产生基因功能。
