细胞衰老过程中G3BP1减少通过提高SVIL mRNA稳定性上调SVIL表达并选择性促进衰老相关表型

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：G3BP1 reduction during cellular senescence promotes SVIL expression and selected senescence-associated phenotypes

　　

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）可通过多种转录后机制调控基因表达，包括控制mRNA稳定性。在本研究中，研究人员将Ras GTPase-activating protein-binding protein 1（G3BP1）鉴定为supervillin（SVIL）表达的转录后调控因子。G3BP1蛋白水平在多种衰老模型中持续降低，而SVIL mRNA和SVIL蛋白水平升高。核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）分析显示，SVIL mRNA与含G3BP1的核糖核蛋白复合物相关，并且在增殖细胞中敲低G3BP1可延长SVIL mRNA半衰期并增加SVIL表达。特别地，SVIL过表达增加了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，并选择性地升高一部分衰老相关分泌表型（SASP）相关mRNA。这些发现提示，衰老过程中G3BP1表达降低通过增加SVIL mRNA稳定性促进SVIL上调，而SVIL升高可能促进选定的衰老相关表型，包括SASP相关mRNA表达增加。

细胞衰老（cellular senescence）是由端粒缩短、DNA损伤、氧化应激和癌基因激活等压力诱导的持续性生长停滞状态。衰老细胞具有扁平增大形态、衰老相关异染色质灶、基因表达改变和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加等特征，并常呈现衰老相关分泌表型（SASP），即表达和分泌促炎细胞因子、生长和血管生成因子以及基质金属蛋白酶等。SASP可有益于组织修复，但衰老细胞负担增加导致的持续SASP可促进慢性炎症、病理性血管生成，并对周围细胞和全身产生不良影响。Ras GTPase-activating protein-binding protein 1（G3BP1）是一种从酵母到人类高度保守的多功能RNA结合蛋白（RBP），可调控靶转录本稳定性，结合靶mRNA高度结构化的3^′非翻译区（3^′UTR）并促进结构介导RNA衰减（SRD），也可结合RNA G-四链体（rG4s）调节稳定性；然而G3BP1在细胞衰老中的转录后调控作用尚不完全清楚。supervillin（SVIL）是质膜相关F-actin结合蛋白，属于villin/gelsolin超家族，参与细胞分裂、黏着斑、基质降解和足体形成，在核内参与H3K9去甲基化和染色质代谢，并参与癌症进展、血管生成、转移和上皮–间质转化。但SVIL在细胞衰老中的调控和功能仍不清楚。因此，研究人员开展本研究，旨在解析G3BP1对SVIL表达的转录后调控及其对衰老相关表型的影响。

研究人员发现，G3BP1蛋白水平在多种衰老模型中降低，而SVIL mRNA和蛋白水平增加；SVIL mRNA与含G3BP1的核糖核蛋白（RNP）复合物相关，G3BP1负向调控SVIL mRNA稳定性；G3BP1缺失和SVIL过表达可增加SA-β-gal活性并选择性升高部分SASP相关mRNA。该研究提示，衰老过程中G3BP1降低通过增加SVIL mRNA稳定性导致SVIL上调，而SVIL升高促进选定的衰老相关表型。其意义在于，将G3BP1依赖的SVIL mRNA稳定性调控识别为一种与细胞衰老相关的转录后机制。

为开展研究，研究人员使用人肺WI-38成纤维细胞和人皮肤BJ成纤维细胞，分别来源于Coriell Cell Repositories和ATCC；建立复制性衰老及多柔比星（Dox）诱导的应激性早熟衰老（SIPS）模型。主要技术包括RT-qPCR、Western blot、核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）、转录抑制后mRNA半衰期检测、慢病毒介导的G3BP1短发夹RNA（shRNA）敲低和小干扰RNA（siRNA）敲低，以及SVIL过表达。研究人员还整合公共RNA-seq数据（GSE130727）、G3BP1增强型交联免疫沉淀测序（eCLIP-seq）相关转录本及公共蛋白组数据以筛选候选基因。统计采用双尾非配对Welch t检验，多重比较采用Holm–?ídák校正。

研究结果部分：
G3BP1蛋白水平在多种衰老模型中下降。通过持续传代WI-38细胞建立复制性衰老，细胞呈现扁平增大形态且SA-β-gal活性显著增加，Western blot显示G3BP1蛋白水平显著降低，RT-qPCR显示G3BP1 mRNA轻微但显著降低。在Dox诱导的WI-38 SIPS模型和复制性衰老BJ细胞中，SA-β-gal活性增加，G3BP1蛋白降低，但G3BP1 mRNA无显著变化。因此，G3BP1 mRNA水平在不同衰老模型中存在差异，而G3BP1蛋白水平在三种模型中均降低。

SVIL mRNA是随衰老增加的候选G3BP1相关转录本。研究人员将eCLIP-seq来源的G3BP1相关转录本与复制性衰老WI-38细胞中上调的转录本（log₂倍数变化≥1且p值≤0.01）取交集，鉴定出SVIL、AKR1B1、CLSTN1和CD59四个候选转录本；RT-qPCR证实这些mRNA在衰老WI-38细胞中均显著增加。结合公共蛋白组数据，研究人员优先选择SVIL进一步研究。衰老细胞中SVIL mRNA半衰期延长，SVIL蛋白水平升高；在Dox诱导衰老WI-38细胞和复制性衰老BJ细胞中，SVIL mRNA和蛋白也增加。随群体倍增水平（PDL）增加，G3BP1蛋白逐渐降低，而SVIL蛋白在晚期PDL显著增加。

SVIL mRNA与含G3BP1的RNP复合物相关，并受G3BP1负向调控。RIP分析显示，与对照IgG免疫沉淀相比，SVIL mRNA在G3BP1免疫沉淀中富集，提示SVIL mRNA与含G3BP1的RNP复合物相关。在增殖WI-38细胞中用shRNA敲低G3BP1后，SA-β-gal活性增加，SVIL和DPP4蛋白呈增加趋势，而p53和p21蛋白无明显改变；RT-qPCR显示SVIL和p21 mRNA显著增加。G3BP1敲低显著增加SASP相关的IL6和CCL5 mRNA，而IL1A、IL1B、IL8、CCL2和CCL7 mRNA无显著变化。利用siRNA敲低G3BP1后，SVIL mRNA半衰期从约8 h延长至超过12 h，表明G3BP1负向调控SVIL mRNA稳定性。

SVIL过表达增加SA-β-gal活性并选择性升高SASP相关mRNA。在增殖WI-38细胞中慢病毒过表达SVIL后，SA-β-gal活性显著增加，SIRT1蛋白水平显著降低，而DPP4、p16、p21和SCAMP4蛋白水平无显著变化；RT-qPCR显示SVIL过表达选择性增加SASP相关的IL6、IL8和CCL7 mRNA，而其他SASP相关转录本和衰老标志物转录本无显著变化。这些结果提示，SVIL升高促进选定的衰老相关表型，而非诱导广泛的衰老程序。

讨论部分总结：G3BP1是参与mRNA稳定性转录后调控的RBP，但其在细胞衰老中的作用尚未充分表征。本研究将SVIL mRNA鉴定为受G3BP1负向调控的转录本，并研究其与衰老相关表型的潜在关系。G3BP1蛋白在复制性衰老WI-38、Dox诱导衰老WI-38和复制性衰老BJ细胞中降低；相反，SVIL mRNA和蛋白在衰老细胞中增加，SVIL mRNA在衰老WI-38细胞中更稳定。SVIL mRNA与含G3BP1的RNP复合物相关，G3BP1缺失延长SVIL mRNA半衰期并增加SVIL表达，同时诱导部分衰老相关变化。虽然SVIL过表达降低SIRT1蛋白水平，但DPP4及经典衰老标志物p16和p21无显著变化；且SVIL过表达仅显著增加IL6、IL8和CCL7 mRNA，而G3BP1缺失显著增加IL6和CCL5 mRNA，两者影响的SASP相关mRNA仅部分重叠。因此，SVIL可能贡献于选定的衰老相关表型，而非完整衰老程序；G3BP1缺失后的更广泛衰老相关变化不能完全归因于SVIL升高。讨论还指出，SVIL作为肌动蛋白和肌球蛋白II结合支架，其升高是否直接影响衰老过程中的细胞骨架组织尚需进一步研究。

研究结论部分翻译：总之，研究人员鉴定出SVIL mRNA是一种与含G3BP1的RNP复合物相关的转录本，并表明G3BP1负向调控SVIL mRNA稳定性。研究人员的发现提示，衰老过程中G3BP1表达降低通过增加mRNA稳定性促进SVIL上调，并且SVIL表达升高选择性地影响SASP相关基因表达。这些结果将G3BP1依赖的SVIL mRNA稳定性调控确定为一种与细胞衰老相关的转录后机制。